王鳳婷， 靳盼盼， 劉 芳， 孫芝蘭， 吳海虹， 王道營(yíng)， 許曉曦， 徐為民

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

食品的安全、質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是人們密切關(guān)注的問題[1]。食品在收獲、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過程中容易變質(zhì)[2]，產(chǎn)生有害物質(zhì)或滋生新的致病菌[3]危害人體健康。腸球菌存在于人或動(dòng)物消化道內(nèi)，特定條件下會(huì)成為病原體引發(fā)感染性疾病[4]，人感染會(huì)引起泌尿系統(tǒng)感染、心內(nèi)膜炎、傷口感染等，動(dòng)物感染會(huì)引發(fā)腦炎、關(guān)節(jié)炎等[5]。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為腸球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，屬于消化道內(nèi)正常菌群，但污染食品后會(huì)引發(fā)疾病發(fā)生，作為食源性致病菌已在生的豬肉、雞肉、牛肉及其他動(dòng)物源食品中檢出[6-7]。由于抗生素的大量使用，糞腸球菌已經(jīng)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，因此在臨床治療中有一定難度[8]。吳悠[9]等使用齊墩果酸和二甲基亞砜有效抑制了糞腸球菌的生長(zhǎng)，Tong等[10]研究了多西環(huán)素、枸櫞酸和去污劑組成的混合物(MTAD)與乳酸鏈球菌素(Nisin)復(fù)配對(duì)糞腸球菌的抑菌機(jī)理。

在肉類和家禽加工廠中使用最普遍的消毒劑即為有機(jī)酸[11]，乳酸作為三大有機(jī)酸之一[12]，能夠參與人體正常的代謝[13]，在達(dá)到殺菌目的的同時(shí)不對(duì)人體產(chǎn)生危害。乳酸具有很強(qiáng)的防腐保鮮功能，可作為食品添加劑用于果酒、飲料、肉類、食品等的加工中，具有調(diào)節(jié)pH、抑菌、調(diào)味、保持色澤等作用[14]。乳酸并非食物[15]，廣泛存在于發(fā)酵類食品中[16]，如酸奶、干酪、泡菜等。國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于乳酸菌及其細(xì)菌類產(chǎn)物抑菌特性及機(jī)理的報(bào)道[17-18]，但關(guān)于乳酸抑菌效果及機(jī)理的研究較少。本研究擬以一株從肉制品中分離得到的糞腸球菌為試驗(yàn)菌株，研究乳酸對(duì)其的殺菌作用及機(jī)理，以期為今后以乳酸為基礎(chǔ)殺菌劑和保鮮劑的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用菌株為糞腸球菌(EnterococcusfaecalisR612-Z1)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所保存。試驗(yàn)用的腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物公司。乳酸購(gòu)自天津科密歐生物技術(shù)公司，熒光探針羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-cFDA]和3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]均購(gòu)自Sigma公司，碘化丙啶(PI)購(gòu)自生工生物工程公司，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 儀器與設(shè)備

所用儀器和設(shè)備主要有Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD公司產(chǎn)品)，PE(Ultra View VOX)轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡(鉑金埃爾默公司產(chǎn)品)，EVO-LS10掃描電子顯微鏡(蔡司公司產(chǎn)品)和BioPhotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf公司產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng) 將凍存管中的糞腸球菌R612-Z1接種于新鮮的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)再次轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，備用。

1.3.2 細(xì)菌活性試驗(yàn) 按培養(yǎng)基體積1.00%接種活化后的糞腸球菌R612-Z1菌液于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)到OD600值為1.0時(shí)，取20 ml菌液分別置于不同的離心管中，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，然后在各管中分別加入相同體積的乳酸溶液，其濃度分別為0.25%、0.50%、1.00%。將菌懸液放入搖床中，分別在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取樣，使用0.1 mol/L PBS緩沖液按照10倍遞增稀釋法[19]稀釋樣品至相應(yīng)濃度，取100 μl均勻涂布于BHI固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄菌數(shù)。

1.3.3 掃描電鏡 按培養(yǎng)基體積1.0%接種活化后的糞腸球菌R612-Z1菌液于BHI液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌，去掉上清，加入同體積且質(zhì)量濃度為1.0%的乳酸，以只加入相同體積PBS緩沖液為對(duì)照。37 ℃處理2 h，4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，再用PBS緩沖液洗滌3次，除凈上清，4 ℃下用2.5%的戊二醛固定12 h[20]。在掃描電子顯微鏡下觀察菌體表面形態(tài)的變化。

1.3.4 細(xì)胞膜滲透性試驗(yàn)

1.3.4.1 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) 使用羧基熒光素雙乙酸酯[5(6)-cFDA]和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞[21]。取對(duì)數(shù)期的菌液在4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體沉淀，用0.85%NaCl溶液洗滌菌泥后，其中一份加入同體積質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸，另一份加入同體積生理鹽水的菌懸液作為對(duì)照，室溫下處理2 h，每15 min振蕩1次。收集菌泥重新懸浮在500 μl的生理鹽水中，加入熒光探針cFDA(終濃度為100 μmol/L)，避光保存10 min，然后加入PI(終濃度為30 μmol/L)，避光反應(yīng)10 min?；旌弦弘x心后用500 μl生理鹽水懸浮菌泥，取3 μl菌液到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4.2 胞外ATP及紫外吸收物質(zhì)的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期的菌液在4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌泥，使用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，將菌泥懸浮在質(zhì)量濃度為1%的乳酸溶液中，25 ℃下處理，分別在0 min、10 min、30 min、60 min、120 min、180 min取樣。將樣品于4 ℃、10 000g下離心1 min，取上清測(cè)定其胞外小分子ATP濃度和紫外吸收物質(zhì)(主要為核酸和蛋白質(zhì)等)濃度的變化。按照ATP測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定樣品中ATP的含量，先測(cè)出ATP濃度與熒光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在樣品中加入ATP檢測(cè)試劑，混合均勻后通過測(cè)定其化學(xué)發(fā)光值來(lái)確定ATP的濃度[22]。紫外吸收物質(zhì)的濃度以紫外分光光度計(jì)測(cè)定的OD260值來(lái)表示。

1.3.5 流式細(xì)胞儀 使用方法1.3.4.1中處理好的菌液，依次用cFDA和PI染色[23]，于4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌體，除去多余的熒光探針后，重懸于0.01 mol/L PBS緩沖液中。在檢測(cè)過程中以低速率(1 s 400～600個(gè))收集50 000個(gè)細(xì)胞，分別在525 nm和620 nm處檢測(cè)樣品綠色熒光和紅色熒光，然后轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。通過分析每個(gè)區(qū)域細(xì)胞的百分比來(lái)確定糞腸球菌的損傷程度。

1.3.6 細(xì)胞電勢(shì)能的測(cè)定 使用熒光探針3,3-Dipropylthiadicarbocyanine iodide[DiSC3(5)]來(lái)測(cè)定糞腸球菌膜電位的變化。將活化好的菌液按培養(yǎng)基體積的1%接種于腦心浸液肉湯(BHI)液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，于4 ℃下6 000g離心10 min，收集菌泥。使用5.0 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)與5.0 mmol/L葡萄糖配置的緩沖液(緩沖液A)洗滌菌泥2次[24]，然后將菌泥重懸于緩沖液A中，加入終濃度為0.5 μmol/L的熒光探針DiSC3(5)，室溫放置15 min，加入終濃度為100.0 mmol/L的KCl溶液，平衡K+濃度后，在樣品中加入乳酸，每個(gè)樣品取200 μl加入黑色的NBS板中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化(激發(fā)波長(zhǎng)為622 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為670 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果

不同濃度的乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果如圖1顯示，樣品的初始菌數(shù)約為 1×108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%的乳酸在10 min內(nèi)全部殺死細(xì)菌，0.25%和0.50%的乳酸全部殺死細(xì)菌分別需要60 min和30 min。在最初檢測(cè)點(diǎn)(0 min)，與對(duì)照相比，加入乳酸的樣品的菌數(shù)均有減少，這是由于樣品中添加乳酸后從混勻到取樣需要一定時(shí)間，同時(shí)也說明乳酸對(duì)糞腸球菌的殺菌作用明顯，并且殺菌迅速。

糞腸球菌菌數(shù)的對(duì)數(shù)值小于等于1.4時(shí)，菌數(shù)不可檢測(cè)；未加入乳酸的樣品為對(duì)照。圖1 不同濃度的乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1的殺菌效果Fig.1 The antibacterial effect of lactic acid(LA) on Enterococcus faecalis R612-Z1 at different concentrations

2.2 乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖2顯示，未經(jīng)乳酸處理的對(duì)照組細(xì)胞完整，表面光滑，呈規(guī)則的球形，細(xì)胞間隙明顯。經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理1 h后，細(xì)胞外膜溶解，部分細(xì)胞壁缺失，菌體連成片，細(xì)胞嚴(yán)重變形，呈不規(guī)則球形，胞外能明顯看到有內(nèi)容物漏出。乳酸處理對(duì)糞腸球菌R612-Z1的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜造成破壞[25]，導(dǎo)致內(nèi)容物漏出。

2.3 乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1細(xì)胞膜滲透性的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦結(jié)果 細(xì)菌細(xì)胞通過核酸熒光探針5(6)-cFDA和核酸熒光探針PI進(jìn)行染色，根據(jù)染色結(jié)果(圖3)可以直觀地看出細(xì)胞膜通透性的變化情況。5(6)-cFDA是一種疏水性復(fù)合物[21]，能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，在非特異性脂酶水解作用下生成羧基熒光素(cF)，呈綠色熒光。PI僅能進(jìn)入受損細(xì)胞，與DNA或RNA結(jié)合后呈現(xiàn)紅色熒光，PI進(jìn)入胞內(nèi)后，cFDA發(fā)出的熒光變?nèi)鮗26]。因此，未受損的細(xì)胞呈綠色，破損的細(xì)胞呈紅色。未經(jīng)乳酸處理的樣品(圖3A)主要為綠色熒光，經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理后幾乎所有細(xì)胞表現(xiàn)為紅色熒光(圖3B)，有少量的細(xì)胞損傷較輕，呈黃色，說明乳酸處理后糞腸球菌R612-Z1細(xì)胞膜的通透性增加了。

A：未經(jīng)乳酸處理的對(duì)照組細(xì)胞；B：經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理1 h后的細(xì)胞。圖2 乳酸處理糞腸球菌的掃描電鏡觀察Fig.2 SEM images of LA-treated E. faecalis cells

A：未經(jīng)乳酸處理的對(duì)照組細(xì)胞；B：經(jīng)過質(zhì)量濃度為1.00%乳酸處理1 h后的細(xì)胞。圖3 乳酸處理糞腸球菌后的激光共聚焦結(jié)果Fig.3 CLSM images of LA-treated E. faecalis cells

2.3.2 胞外ATP及紫外吸收物質(zhì) 使用試劑盒中提供的ATP標(biāo)準(zhǔn)品確定ATP濃度與熒光值的定量關(guān)系(Y=222 856.00x+784.01，R2=0.999)，然后通過測(cè)定樣品熒光值來(lái)確定樣品中ATP的濃度。圖4顯示，0 min時(shí)，對(duì)照組樣品的ATP濃度為7.28 nmol/ml，檢測(cè)期間濃度變化不大，質(zhì)量濃度為1.00%乳酸處理樣品的ATP濃度為126.72 nmol/ml，在隨后測(cè)定的3 h內(nèi)，ATP濃度基本維持穩(wěn)定。通過測(cè)定紫外吸收物質(zhì)的濃度來(lái)確定乳酸對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，260 nm處主要為DNA、RNA、代謝產(chǎn)物、離子等物質(zhì)的吸收峰[27]。圖5顯示，0 min時(shí)，對(duì)照組樣品吸光度為0.25，3 h內(nèi)保持穩(wěn)定，乳酸處理組吸光度為1.03，其后吸光度保持在 0.90～1.00，說明乳酸處理后，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，胞內(nèi)ATP及核酸物質(zhì)泄漏。由于加入乳酸后從混勻到取樣需要一定時(shí)間，因此在0 min測(cè)得吸光度值較高，由此也可以說明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%的乳酸作用迅速，瞬間對(duì)細(xì)胞膜造成破壞。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對(duì)照。圖4 胞外ATP濃度的變化Fig.4 Changes of concentrations of extracellular ATP

2.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 通過熒光探針cFDA和PI雙染[28]對(duì)細(xì)胞的完整性進(jìn)行驗(yàn)證，cFDA可以進(jìn)入所有細(xì)胞，而PI僅能進(jìn)入膜損傷的細(xì)胞且與核酸親和力更強(qiáng)，可代替已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的cFDA分子。流式細(xì)胞儀分析后，可按細(xì)菌細(xì)胞的損傷狀態(tài)將其分為完整細(xì)胞、受損細(xì)胞、死亡細(xì)胞和未染色細(xì)胞。細(xì)菌樣品處理后，利用流式細(xì)胞儀獲得糞腸球菌流式點(diǎn)狀圖，首先以對(duì)照組樣品為基準(zhǔn)劃分象限，象限Q1-LR為cFDA染色的完整活細(xì)胞，象限Q1-UR為雙重染色的受損活細(xì)胞，象限Q1-UL為PI染色的死亡細(xì)胞，象限Q1-LL為未染色細(xì)胞。圖6顯示，糞腸球菌R612-Z1經(jīng)過1.00%乳酸處理后細(xì)胞的分布與對(duì)照樣品有明顯差異，未經(jīng)乳酸處理的細(xì)菌樣品中99.7%為活細(xì)胞，經(jīng)過乳酸處理后的細(xì)菌樣品中93.8%為死細(xì)胞，5.2%為受損細(xì)胞。Booyens[23]根據(jù)流式細(xì)胞儀的結(jié)果，分析大蒜精油處理3種雙歧桿菌前后其細(xì)胞膜的損傷程度。對(duì)照組樣品和處理組樣品中分別存在0.2%和1.0%未染色細(xì)胞，Silva[29]也指出流式數(shù)據(jù)中存在未能染色的細(xì)胞，對(duì)這種細(xì)胞存在的原因有2種猜測(cè)[23]。第一，有一部分細(xì)胞膜在處理過程中經(jīng)歷嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致其核酸流出，而2種熒光探針均是對(duì)核酸進(jìn)行染色，Wang[25]也指出乳酸能夠破壞細(xì)胞質(zhì)膜及胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)。第二，細(xì)胞聚集成團(tuán)或成鏈，降低了染色率。綜上所述，糞腸球菌R612-Z1經(jīng)過1.00%乳酸處理后大部分細(xì)菌死亡，少部分受損，與激光共聚焦的結(jié)果相呼應(yīng)，說明乳酸對(duì)糞腸球菌具有嚴(yán)重的破壞作用，可對(duì)其細(xì)胞膜造成損傷。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對(duì)照。圖5 紫外吸收物質(zhì)吸光度變化Fig.5 Changes of absorbance of UV-absorbing materials

A：未經(jīng)乳酸處理的細(xì)菌樣品；B：經(jīng)過乳酸處理后的細(xì)菌樣品。Q1-LR：cFDA染色的完整活細(xì)胞；Q1-UR：雙重染色的受損活細(xì)胞；Q1-UL：PI染色的死亡細(xì)胞；Q1-LL：未染色細(xì)胞。圖6 乳酸處理后的糞腸球菌流式點(diǎn)狀圖Fig.6 Flow cytometry dot plots of LA-treated E. faecalis cells

2.4 乳酸對(duì)糞腸球菌R612-Z1細(xì)胞膜電勢(shì)能的影響

通過測(cè)定細(xì)胞膜電勢(shì)能變化，進(jìn)一步研究乳酸對(duì)糞腸球菌的作用。熒光探針DiSC3(5)是一種對(duì)膜電勢(shì)變化敏感的陽(yáng)離子熒光染料[30]，能夠在完整的極化細(xì)胞膜中累積并且自行淬滅，乳酸處理后細(xì)胞膜去極化[31]，導(dǎo)致與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合的熒光探針脫落進(jìn)入溶液中，熒光值增加。對(duì)樣品在670 nm處的熒光進(jìn)行檢測(cè)(圖7)，尼日利亞菌素和纈氨霉素分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，加入KCl平衡細(xì)胞內(nèi)外K+濃度后測(cè)定熒光值為13 000左右，對(duì)照組樣品熒光值在測(cè)定期間保持穩(wěn)定，加入尼日利亞菌素后略有下降，加入K+載體纈氨霉素后熒光值迅速上升，處理1 min時(shí)熒光值為28 159，加入1.00%乳酸處理后的樣品的熒光值在1 min內(nèi)變化較快，之后趨于穩(wěn)定，但熒光值低于陽(yáng)性對(duì)照樣品的熒光值。熒光值的迅速上升說明乳酸對(duì)糞腸球菌作用迅速，細(xì)胞膜快速去極化對(duì)其功能造成破壞。

未經(jīng)乳酸處理的樣品為對(duì)照。圖7 乳酸處理后糞腸球菌膜電勢(shì)變化Fig.7 Change of membrane potential of LA-treated E. faecalis cells

3 結(jié) 論

乳酸殺菌迅速，加入乳酸后菌數(shù)迅速下降，濃度為0.25%、0.50%、1.00%的乳酸分別在60 min、30 min、10 min內(nèi)達(dá)到完全殺菌的效果，乳酸作用于糞腸球菌R612-Z1后使其胞內(nèi)ATP及核酸類物質(zhì)快速釋放到胞外。Sun等[32]的研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用乳酸鏈球菌素(Nisin)和乳酸桿菌表層分離蛋白SlpB或者2種物質(zhì)復(fù)配使用后也會(huì)使胞外ATP和核酸物質(zhì)增加，ATP濃度在反應(yīng)1.5 h時(shí)達(dá)到最高，260 nm處的吸光值在反應(yīng)6.0 h時(shí)達(dá)到最大，說明復(fù)配物對(duì)細(xì)菌作用緩慢。乳酸處理糞腸球菌后，細(xì)胞形狀無(wú)明顯變化，但有胞內(nèi)物質(zhì)流出。乳酸對(duì)于細(xì)菌的破壞主要是破壞其膜通透性，對(duì)細(xì)胞整體形態(tài)無(wú)明顯影響[33-34]。使用肉桂醛作為抑菌劑處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌時(shí)，胞外核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量增多，電導(dǎo)率增大，細(xì)胞膜電勢(shì)變化[35]。因此，細(xì)胞膜通透性的變化是多種抑菌物質(zhì)達(dá)到抑菌或殺菌作用的原因。通過研究發(fā)現(xiàn)，乳酸處理迅速改變了細(xì)胞膜內(nèi)外電勢(shì)，增加了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物流出，從而起到了抑菌作用，但乳酸導(dǎo)致細(xì)胞膜分子結(jié)構(gòu)階段損傷的作用機(jī)制仍需要深入研究。

質(zhì)量濃度為1.00%的乳酸處理細(xì)菌1 h后，通過掃描電鏡觀察到細(xì)胞外部被內(nèi)容物包裹，同時(shí)胞外ATP濃度及紫外吸收物質(zhì)濃度的增加也說明胞內(nèi)有物質(zhì)滲漏。通過cFDA和PI染色，在激光共焦顯微鏡與流式細(xì)胞儀下觀察，乳酸處理后大部分細(xì)胞死亡，紅色熒光明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光探針PI進(jìn)入胞內(nèi)。因此，乳酸作用于糞腸球菌時(shí)會(huì)快速破壞其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，胞內(nèi)的內(nèi)容物如ATP、核酸等快速滲出，達(dá)到殺菌效果。

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