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        番鴨IGF-I基因克隆及其在肌肉組織發(fā)育中的表達規(guī)律

        2018-03-07 07:32:50段修軍孫國波
        江蘇農業(yè)學報 2018年1期
        關鍵詞:差異

        董 飚, 王 健, 段修軍, 孫國波

        (江蘇農牧科技職業(yè)學院,江蘇 泰州 225300)

        采用性狀獨立淘汰法、綜合指數法等傳統(tǒng)的育種方法使畜禽生產性能得到了較大幅度的提升,但是生產性能到達一定水平后很難繼續(xù)取得較大成效。隨著分子生物學技術的出現和快速發(fā)展,一些基因的功能得到了驗證,基于功能基因的現代育種手段可以快速、有效地提升畜禽生產性能。畜禽動物的生長受到神經內分泌生長軸的調控,其中起主導作用的是下丘腦-垂體-靶器官途徑,此生長軸涉及胰島素樣生長因子、肌肉生長抑制因子、生長激素及其受體等一些功能基因。

        胰島素樣生長因子(insulin like growth factors,IGF)最先在大鼠體內發(fā)現,其介導生長激素的促生長作用,與胰島素許多結構高度相似,能與胰島素受體競爭性結合,有類似胰島素的作用,因此獲得其名稱。胰島素樣生長因子-I(IGF-I)是胰島素樣生長因子家族成員之一,是細胞生長增殖的調控信號之一,對機體細胞增殖、分化具有重要調控作用,在畜禽生長過程中發(fā)揮調控瘦肉率的作用。IGF-I基因在組織中的表達量和其功能有著密切的關系,對其進行研究具有重要的意義。在對大圍山微型雞、武定雞和艾維茵肉雞的研究中發(fā)現,雞肝臟中IGF-I基因的表達量與體質量、體尺呈顯著正相關[1]。在孵化13 d的鴨胚肝臟組織中就可以檢測到IGF-I基因的mRNA表達,在早期生長發(fā)育過程中肝臟組織中IGF-I基因mRNA表達量與體質量的變化趨勢一致,呈現極顯著正相關[2]。同樣,IGF-I在鴨肝臟組織中表達量有特定的發(fā)育模式且在品種之間存在差異[3]。在孵化7~17 d的雞、鵪鶉及雜交后代胚胎肌肉中就可以檢測到IGF-I基因mRNA表達,在孵化10 d時達到第一次峰值,孵化 15~16 d時達到第二次峰值,而且IGF-I基因mRNA表達規(guī)律與成肌細胞增殖和肌管融合規(guī)律一致[4]。雞胚胎孵化中期(孵化9 d和孵化13 d)腿部肌肉組織IGF-I基因mRNA表達量顯著高于孵化后期(孵化20 d),這可能與胚胎腿部肌肉的發(fā)育速度有關,中期發(fā)育速度較快,后期發(fā)育速度相對遲緩[5]。高郵鴨和金定鴨胚胎胸肌和腿肌成肌細胞中IGF-I基因mRNA表達規(guī)律基本一致[6]。在家禽胚胎期和早期生長發(fā)育過程中,IGF-I基因在組織中的表達研究已經取得一定的成績。

        在家禽生長發(fā)育過程中,IGF-I基因在肌肉組織中又是如何表達的。鑒于此,本研究根據GenBank上公布的禽類IGF-I基因序列設計引物,通過克隆、測序獲得番鴨IGF-I基因序列,并采用生物學軟件進行分析。同時采集番鴨早期第2、4、6、8、10、13周齡的肌肉組織,采用實時熒光定量PCR方法檢測IGF-I基因在番鴨肌肉生長過程中的mRNA表達規(guī)律,為開展IGF-I基因功能研究增加資料。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        在番鴨2、4、6、8、10、13周齡時,各個時期末隨機抽取10只鴨,公母各半。屠宰放血后,采集胸肌、腿肌組織置于液氮速凍,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 試驗方法

        1.2.1 引物的設計 根據GenBank中公布的禽類IGF-I基因序列,用DNAMAN軟件尋找該基因保守區(qū)并設計引物,引物由上海桑尼生物技術有限公司進行合成。引物序列及信息見表1,其中引物A1是用于IGF-I基因克隆,A2、A3分別用于實時熒光定量PCR時用于擴增IGF-I、β-actin基因。

        表1基因克隆和mRNA表達所用引物信息表

        Table1ThebasicinformationofprimersusedingenecloningandmRANexpression

        引物名稱 引物序列(5'→3')擴增產物(bp)退火溫度(℃)A1F:TGCCCTCAACATCTCA-CATC56355R:TGGCACATTCATTCT-TCATTCTA2F:TGCTTCCAGAGTTGTGAC-CT15660R:TCCTGTGTTCCCTCTACT-TGA3F:CTATGTCGCCCTG-GATTTCG14760R:AAAGATGGCTG-GAAGAGGGC

        1.2.2 RNA提取及反轉錄 采用Trizol試劑提取肌肉組織中總RNA,用核酸濃度測定儀檢測RNA濃度和純度,并用瓊脂糖凝膠快速電泳檢測RNA的質量。檢測完成按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行操作,以適量RNA為模板、Oligo(DT)為引物在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。

        1.3 PCR擴增

        以cDNA為模板,引物A1進行PCR擴增獲得IGF-I片段。PCR反應體系為25 μl:10×PCR 緩沖液 (無Mg2+) 2.5 μl,dNTP (2.5 mmol/L)2.0 μl,MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl,上、下游引物 (10 μmol/L)各 1.0 μl,Taq聚合酶 (5 U/μl) 0.2 μl,cDNA模板 1.0 μl,dH2O 16.8 μl。

        1.4 克隆測序

        將純化后的PCR產物與pMD19-T載體連接,然后轉化到感受態(tài)細胞DH5-α中,在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)12 h。隨機挑取菌落,用菌液PCR法和酶切質粒法篩選陽性克隆,每對引物挑選2個陽性克隆送上海桑尼生物技術有限公司測序。

        1.5 實時熒光定量PCR檢測

        反應體系為:UltraSYBR Mixture (2×) 10.0 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl,模板 2.0 μl,加入滅菌蒸餾水至20.0 μl。反應程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環(huán)。

        1.6 統(tǒng)計分析

        基因測序結果用NCBI上的BLAST進行序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/),序列的翻譯和不同物種之間序列進化關系作圖用DNAMAN 6.0軟件進行分析。不同組別之間基因表達差異性采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數據分析。

        2 結果與分析

        2.1 IGF-I基因PCR擴增結果

        取任意1個番鴨胸肌組織提取總RNA,然后進行反轉錄合成cDNA,以引物A1進行PCR擴增,擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖1所示,PCR擴增產物處于 500~750 bp,與預期的結果較為相似,初步斷定其可能是IGF-I基因的序列。

        1:分子量標準,DL2000;2、3:引物A1的PCR擴增產物。圖1 番鴨IGF-I基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IGF-I gene PCR products about Muscovy duck

        2.2 序列分析結果

        通過克隆測序獲得563 bp的cDNA序列(圖2)。運用軟件分析發(fā)現這段序列包括了91 bp的5′端、462 bp的編碼區(qū)、10 bp的3′端,編碼153個氨基酸。

        圖2 番鴨IGF-I基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence of IGF-I gene on Muscovy duck

        2.3 物種間序列同源性比較

        不同物種之間IGF-I基因編碼區(qū)核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列同源性見表2、表3。由表2可知,番鴨與野鴨(EU031044)、鵝(DQ662932)、雞(FJ977570)、人(NM_000618)、小鼠(NM_001111275)、牛(HQ324241)、豬(JX827417)等物種IGF-I基因核苷酸序列同源性達 76.8%~99.1%,其中與鵝同源性最高,與小鼠的同源性最低。由表3可知,番鴨與野鴨、鵝、雞的氨基酸序列同源性較高,均在98.7%以上,與小鼠、牛、豬的同源性為 77.8%~83.7%。

        表2不同物種IGF-I基因核苷酸序列的相似性

        Table2SimilaritycomparisonofnucleotidesequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

        動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.9鵝99.199.4雞98.198.398.1人80.580.781.080.7小鼠76.876.876.877.388.7牛79.479.979.980.193.586.8豬80.380.780.780.793.588.394.4

        表3不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列的相似性

        Table3SimilaritycomparisonofaminoacidsequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

        動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.7鵝99.399.3雞98.798.799.3人83.783.083.784.3小鼠77.877.177.877.891.5牛83.082.483.083.796.190.2豬83.783.083.784.396.190.298.0

        根據IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源性構建關系樹(圖3),主要分為兩大類,一類是番鴨、野鴨、鵝和雞禽類聚在一起,另外一類是哺乳動物聚在一起,其中豬和牛先聚在一起,然后再與人、小鼠聚在一起。

        圖3 不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源關系樹Fig.3 Homologous relationship tree of IGF-I gene amino acid sequence in different animals

        2.4 肌肉組織IGF-I基因mRNA表達

        本試驗采用qRT-PCR方法檢測了番鴨生長過程中IGF-I基因在胸、腿肌組織中mRNA表達規(guī)律,詳細見表4。在公鴨胸肌組織中,第2周齡IGF-I基因mRNA表達量顯著性高于其他周齡;第6、8、10周齡間基因mRNA表達量無顯著性差異,均顯著性高于第4、13周齡;第4、13周齡間表達量無顯著差異。在母鴨胸肌組織中,同樣第2周齡表達量顯著性高于其他周齡;第6、8周齡間表達量無顯著差異,顯著性高于第4、10、13周齡;第4、10、13周齡間表達量無顯著差異。

        在公鴨腿肌組織中,第2周齡IGF-I基因mRNA表達量最高,顯著性高于其他周齡;第8、10周齡間表達量無顯著性差異,顯著性高于第4、6、13周齡;第6、13周齡間表達量無顯著性差異,顯著性高于第4周齡。在母鴨腿肌組織中,第2周齡IGF-I基因mRNA表達量最大,顯著高于其他周齡;第13周齡表達量顯著高于第4、6周齡,第4、6、10周齡間表達量無顯著差異。

        在肌肉組織中IGF-I基因mRNA的表達量均表現為第2周齡最高,然后下降,在第4周齡出現最低點,不同性別、組織中回升的速度不同,在最后階段,除母鴨腿肌外,其他肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達量再次下降。

        表4番鴨不同時期IGF-I基因表達量

        Table4IGF-IgeneexpressionofMuscovyduckatdifferentstages

        周齡公鴨胸肌腿肌母鴨胸肌腿肌20.74±0.11a0.46±0.04a1.14±0.14a0.28±0.09a40.24±0.04c0.13±0.02d0.16±0.03c0.02±0.01c60.52±0.02b0.21±0.02c0.74±0.03b0.05±0.01c80.61±0.04b0.33±0.03b0.71±0.05b0.07±0.02bc100.61±0.04b0.34±0.04b0.17±0.03c0.09±0.02bc130.21±0.03c0.24±0.04c0.21±0.02c0.14±0.02b

        同一列數據后不同字母表示差異顯著(P<0.0.5)。

        3 討 論

        隨著人類基因組計劃的順利實施完成,生物技術的快速發(fā)展,測序效率的提升,成本的降低等,促進了其他動物基因組測序工作。動物基因組測序結果有利于開展相關基因后續(xù)研究工作。在禽類,雞的基因組序列早已公開,鴨和鵝基因組測序工作已經結束,但是序列未公開發(fā)布。本試驗對番鴨IGF-I基因進行克隆和序列分析,獲得了1個cDNA序列,其中編碼區(qū)序列包括了462 bp,編碼153個氨基酸,番鴨與野鴨、鵝、雞IGF-I基因核苷酸序列的同源性比較高,在98.1%以上,而與人和哺乳動物的同源性在80%左右,物種間的進化關系結果表明鴨IGF-I基因的功能與其他家禽更為相似。

        IGF-I是一種高效能因子,通過影響動物蛋白沉積、肌細胞增殖、成肌細胞分化以及肌管融合等方式促進動物骨骼肌生長發(fā)育[7]。史旭升等[8]在28日齡、56日齡鵝的胸肌、腿肌組織中均可以檢測到IGF-I基因mRNA表達,且28日齡的肌肉中表達量要高于56日齡,這說明IGF-I基因可能參與調控鵝肌肉的生長發(fā)育。Serrano等[9]在第12-16 d的雞胚大腦、胰腺組織中可以檢測到IGF-I基因mRNA的表達,在肝臟中沒有檢測到,出殼后肝臟組織中IGF-I基因的mRNA表達量才逐漸升高,說明胚胎期間所有的IGF-I均來自肝外組織。Richards等[10]發(fā)現火雞孵化第14 d就可以在腦和肝臟組織中檢測到IGF-I基因mRNA表達,但是在整個孵化期間IGF-I基因mRNA表達量都比較低,在出殼后快速上升,第3周齡時組織中IGF-I基因表達量是胚胎期的8倍,腦組織中IGF-I基因mRNA表達量比肝臟組織中高,而且腦組織中的表達量隨著生長逐步上升,在3周齡時達到最高值。試驗結果顯示,肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達量在第2周齡最高,這與Yun等在肉雞上的研究結果[11]較為相似。但是番鴨在第4~6周齡時表達量出現了反彈現象,這又與在雞上的表達存在差異,說明IGF-I基因在家禽早期生長發(fā)育過程所起的作用是相似的,但是會受到物種因素的影響而不同。公番鴨胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達量在第8~10周齡出現下降,而母鴨在10~13周齡出現下降;公鴨腿肌組織中IGF-I基因mRNA表達量在第10周齡出現反彈高峰,而母鴨在13周齡還在反彈。IGF-I基因在公、母鴨肌肉組織中表達規(guī)律的差異可能與公、母番鴨的生長速度不同有關,在前期的工作中可發(fā)現剛出雛時公、母番鴨的體質量較為接近,但是公鴨的生長速度要比母鴨快,在第2周齡開始差異就已經達到了顯著性水平,在10周齡左右公鴨的體質量一般是母鴨的1.5倍[12]。胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達量要比腿肌組織中高,這是否與胸肌組織發(fā)育比褪肌組織發(fā)育遲、發(fā)育時間長有關,還需進一步認證。通過本試驗,闡述了番鴨IGF-I基因在肌肉生長發(fā)育過程中的表達規(guī)律,為進一步研究IGF-I基因的功能以及通過日糧營養(yǎng)調控其表達提供了資料。

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