祝立和，胡盧豐，季劍樂，朱暐

（1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 藥劑科，浙江溫州 325015）

乳腺癌干細胞是乳腺癌組織中的一小部分具有無限增殖、自我更新能力的乳腺癌細胞，是乳腺癌形成、復發(fā)轉(zhuǎn)移、抵抗放化療的根源[1]。根據(jù)不同的干細胞標記物可以分選出不同的乳腺癌干細胞亞群，神經(jīng)節(jié)苷脂GD2陽性（ganlioside GD2+，GD2+）乳腺癌干細胞亞群被認為具有迄今最強大的致瘤能力[2]，但調(diào)節(jié)GD2+乳腺癌干細胞的分子機制尚不清楚。最近研究顯示GD2+乳腺癌干細胞在不同分子分型乳腺癌細胞系中以基底樣乳腺癌細胞系中含量最高[2]，而信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activators of transcription 3，STAT3）信號激活被認為是基底樣乳腺癌的重要特征[3]，故我們推測STAT3在調(diào)節(jié)GD2+乳腺癌干細胞增殖、自我更新中發(fā)揮重要作用。

本研究從基底樣乳腺癌細胞株MDA-MB-231分選GD2+乳腺癌干細胞并進行鑒定，檢測STAT3在GD2+乳腺癌干細胞中的表達，通過研究小分子藥物Stattic選擇性抑制STAT3與GD2+乳腺癌干細胞自我更新能力的相關(guān)性，探討靶向STAT3在治療乳腺癌中的意義。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞株由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室保存；DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）、B27添加劑購自美國Gibco公司；人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；GD2抗體購自美國Abcam公司，STAT3、pSAT3抗體購自美國CST公司，STAT3抑制劑Stattic購自美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液1次。GD2+乳腺癌干細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)基由DMEM/F12（1∶1）、B27（2%）、EGF（20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）組成。置于37 ℃、含5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 干細胞分選：選取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，PBS洗滌2遍后，調(diào)配成1×106個細胞/mL的濃度，按每管100 μL加入到提前準備好的流式管中。每管分別加入GD2抗體2 μL，震蕩混勻后冰上孵育30 min。PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min。向各個管中加入FITC標記的兔抗小鼠IgG 2 μL，震蕩混勻后避光冰上孵育30 min。PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min。FACS緩沖液沖洗并重懸細胞，上流式細胞儀（BD FACS Aria II，美國BD公司）分選。

1.2.3 乳腺球形成實驗：將流式細胞儀分選得到的GD2+/GD2-乳腺癌細胞，以每孔1×103個細胞接種于低黏附的24孔板內(nèi)，干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)觀察，12 d后計算乳腺球數(shù)目及大小。

1.2.4 CCK-8實驗：收集細胞，制成單懸細胞后接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔加入10 mL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值（OD值）。

1.2.5 Western blot法檢測乳腺癌干細胞中STAT3、pSTAT3蛋白的表達：以含10 nmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白裂解液裂解細胞，BCA法（美國Pierce公司）測定總蛋白濃度。行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），Bio-rad浸漬電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白電轉(zhuǎn)膜，依次經(jīng)過封閉、一抗孵育、二抗孵育、化學發(fā)光顯色試劑顯影并攝像。

1.2.6 Stattic抑制實驗：將細胞制成單細胞懸液，每孔1 000個細胞接種于96孔板，Stattic溶解于DMSO，加入細胞培養(yǎng)液稀釋，終體積為200 μL，Stattic終濃度依次為1、2.5、5.0、7.5 μmol/L（藥物濃度參考文獻[4]）。設置對照組為單純細胞懸液加DMSO。每個濃度設3個復孔，處理48 h，觀察乳腺球的數(shù)目、大小及細胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GD2+細胞的分選及鑒定

2.1.1 GD2+細胞的分選及形態(tài)觀察：流式細胞儀分選得GD2+細胞，接種于無血清培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察：GD2+細胞形態(tài)呈紡錘形，細胞間少有黏附；GD2-細胞接種于DMEM培養(yǎng)基，細胞多呈多邊形，胞漿豐富，常見細胞連接成片。見圖1A-B。

2.1.2 乳腺球形成實驗：每1 000個GD2+細胞成球數(shù)目為（22.38±3.44）個，GD2-細胞成球數(shù)目為（7.14±1.14）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=1.37，P＜0.01），GD2+細胞形成的乳腺球大小為（148.47±41.34）μm，大于GD2-細胞的（57.10±13.58）μm，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.14，P＜0.01），提示GD2+細胞有更強的自我更新能力。見圖1C。

2.1.3 增殖實驗：用CCK-8法檢測GD2+細胞、GD2-細胞OD值，并描繪生長曲線。曲線顯示GD2+細胞的生長速度低于GD2-細胞，從第2天開始其增殖差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 GD2+乳腺癌干細胞分選和培養(yǎng)

圖2 GD2+/GD2-細胞的生長曲線

2.2 GD2+/GD2-乳腺癌細胞中STAT3、pSTAT3蛋白表達水平 GD2+細胞較GD2-細胞pSTAT3蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而STAT3蛋白表達2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 GD2+和GD2-乳腺癌細胞中STAT3、pSTAT3蛋白的表達

2.3 Stattic抑制實驗

2.3.1 Stattic對GD2+乳腺癌干細胞自我更新能力的影響：不同濃度Stattic對GD2+乳腺癌干細胞乳腺球形成能力及成球大小均有顯著的抑制作用（P＜0.05），而且這種抑制作用呈現(xiàn)一定濃度依賴關(guān)系，但5.0 μmol/L組與7.5 μmol/L組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

2.3.2 Stattic對GD2+乳腺癌干細胞增殖能力的影響：不同濃度Stattic作用于GD2+乳腺癌干細胞后，CCK-8法分別檢測各組的OD值，DMSO組與不同濃度Stattic干預組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1.0 μmol/L組與2.5 μmol/L、5.0 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與7.5 μmol/L組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2.5 μmol/L組與5.0 μmol/L、7.5 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），5.0 μmol/L組與7.5 μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

3 討論

乳腺癌是一組高度異質(zhì)性的腫瘤，由于形態(tài)學、免疫表型、分子遺傳學上的差異導致了對臨床治療的反應及預后的不同[5-6]。在主要的4種分子分型中（即腔面A型、腔面B型、HER2過表達型、基底樣型），基底樣乳腺癌因其缺乏有效的治療手段、容易復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后最差而成為近幾年乳腺癌研究的熱點之一[7-8]。

圖4 Stattic對GD2+乳腺癌干細胞乳腺球形成和大小的影響

圖5 不同濃度Stattic對GD2+乳腺癌干細胞增殖能力的影響

按照腫瘤干細胞假說，乳腺癌干細胞的存在是乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。乳腺癌干細胞是乳腺癌中一小群具有無限自我更新能力并可導致腫瘤發(fā)生的細胞。這類細胞具有多向分化的能力，能夠耐受放療及化療藥物。而基底樣乳腺癌中的乳腺癌干細胞含量在4種分型乳腺癌中最高，這可解釋其易轉(zhuǎn)移、預后差等特點[9]。

神經(jīng)節(jié)苷脂是一組含有唾液酸的鞘糖脂，分子由疏水的神經(jīng)酰胺和親水的含唾液酸的寡糖鏈組成，廣泛分布于脊椎動物各組織的細胞膜上，其中以神經(jīng)系統(tǒng)含量最為豐富。通常根據(jù)唾液酸數(shù)目不同分為單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）、二唾液酸神神經(jīng)節(jié)苷脂（GD）和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GT）等，每種神經(jīng)節(jié)苷脂還可根據(jù)糖基數(shù)目不同再分幾個亞類，如GD1、GD2、GD3等。其中神經(jīng)節(jié)苷脂GD2是神經(jīng)系統(tǒng)細胞膜的重要組成部分，在細胞膜上充當重要的調(diào)節(jié)細胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的功能。GD2作為表面分子，主要表達在神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚黑素細胞以及其他正常組織[10]。在惡性腫瘤中，GD2通常在神經(jīng)外胚層腫瘤如神經(jīng)母細胞瘤、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤中表達[11-12]；此外GD2也可以在一些肉瘤中表達[13-14]。

2007年MARTINEZ等[9]首先研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂GD2作為骨髓間充質(zhì)干細胞標志物可以分離骨髓間充質(zhì)干細胞。2012年BATTULA等[2]的研究證實GD2作為一種全新的乳腺癌干細胞標志物成功分離出乳腺癌干細胞，并且與此前公認的乳腺癌干細胞標志物相比具有明顯優(yōu)勢。AL-HAJJ等[15]第1次從實體乳腺癌組織中分離出乳腺癌干細胞ESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-細胞，接種1 000個這種表型細胞的NOD/SCID小鼠在12周內(nèi)100%形成腫瘤，是普通乳腺癌細胞致瘤性的50倍。GINESTIER等[16]發(fā)現(xiàn)500個ALDH1+乳腺癌細胞成功在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤，但GD2+細胞僅需10個就可以使得10只NOD/SCID小鼠中的5只成瘤，顯示出迄今最為強大的致瘤能力。故研究GD2+細胞的相關(guān)分子機制，對于治療乳腺癌、特別是基底細胞樣乳腺癌具有重要價值。

本研究以GD2作為干細胞標記物，利用流式細胞儀從基底樣乳腺癌細胞株MDA-MB-231分離出GD2+乳腺癌細胞亞群。通過培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)：GD2+乳腺癌細胞呈紡錘形，表現(xiàn)為間質(zhì)細胞形態(tài)，而GD2-細胞呈胞漿豐富、多邊形的上皮細胞形態(tài)；在細胞增殖實驗中，從第2天開始GD2+細胞的增殖速度明顯低于GD2-細胞，表現(xiàn)為較弱的增殖能力；在乳腺球形成實驗中，GD2+細胞比較GD2-細胞乳腺球形成率明顯更高、乳腺球體積更大，提示具有更強的自我更新能力。這些觀察結(jié)果均符合乳腺癌干細胞的特性。

STAT3是STAT家族的重要成員和多種惡性腫瘤關(guān)系密切。當細胞因子或生長因子等激活STAT3上游的JAK后，活化的JAK募集胞漿中以單體存在的STAT3分子，使與受體結(jié)合的STAT3分子酪氨酸磷酸化形成同源或異源二聚體從受體上釋放下來，進入細胞核調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[17]。據(jù)報道在30%～60%的原發(fā)性乳腺癌中STAT3被激活，表現(xiàn)為酪氨酸705位點磷酸化及與特異DNA序列的結(jié)合[18]。

TELL等[3]進一步闡明了STAT3激活更常見于基底樣乳腺癌，而不是腔A或腔B型乳腺癌，基底樣乳腺癌具有與STAT3信號相關(guān)的獨特mRNA、蛋白質(zhì)和microRNA表達模式，并認為STAT3激活是基底樣乳腺癌的重要分子特征。而基底樣乳腺癌細胞系比其他基因亞型乳腺癌細胞系包含更多的GD2+細胞[2]，故我們推測STAT3的激活與GD2+乳腺癌干細胞的分子調(diào)節(jié)機制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示STAT3蛋白在GD2+/GD2-細胞中均呈陽性表達，但pSTAT3在GD2+細胞表達水平比較GD2-細胞明顯升高，表明STAT3的活化在GD2+乳腺癌干細胞中具有重要意義。我們采用選擇性抑制STAT3磷酸化的小分子藥物Stattic干預GD2+乳腺癌細胞并觀察其乳腺球形成能力、細胞增殖的變化，結(jié)果顯示Stattic對GD2+乳腺癌細胞的乳腺球形成能力、細胞增殖均具有顯著抑制作用，且這種抑制作用與藥物濃度呈現(xiàn)一定依賴關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，STAT3活化在GD2+乳腺癌干細胞調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮重要作用，選擇性抑制STAT3磷酸化，可以抑制GD2+乳腺癌干細胞的自我更新能力。通過阻斷STAT3信號活化抑制GD2+乳腺癌干細胞可能是治療乳腺癌，特別是對一線化療無效的基底細胞樣乳腺癌的一種有效策略。

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