張培趁，石玲燕，周鋒，武文一，余震，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015；3.上海市第十人民醫(yī)院 普通外科，上海 200072）

癌癥惡病質(zhì)（cancer cachexia，CC）是腫瘤患者常見的一種糖脂代謝綜合征[1-2]。鋅-α2-糖蛋白（zinc-alpha2-glycoprotein，ZAG）是一種新型脂質(zhì)動員因子，廣泛分布于肝臟、腎臟、心肌、前列腺和乳腺[3-4]。在脂肪組織中，ZAG與脂聯(lián)素水平呈正相關(guān)，與瘦素水平呈負相關(guān)，后兩者均為重要的脂肪細胞因子[5]。本研究通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸腺癌CC模型，探究腫瘤組織、脂肪組織和血清中ZAG的表達水平與體質(zhì)量減輕、脂聯(lián)素表達水平的相關(guān)性，進一步了解ZAG在CC中調(diào)控脂肪代謝的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠結(jié)腸腺癌細胞株colon-26購自美國菌種保藏中心；雄性BALB/c小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～20 g，SPF級，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所[動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009]；ZAG雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）檢測試劑盒購自美國BioVendor公司；脂聯(lián)素檢測試劑盒購自美國R&D公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin一抗購自北京博奧森生物工程有限公司；ZAG一抗購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組：健康雄性BALB/c小鼠隨機分為2組，即健康對照組（HC組）和造模組。造模組構(gòu)建小鼠結(jié)腸腺癌動物模型，HC組不做處理。各組小鼠均自由攝食飲水。稱重并記錄各組小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 動物模型的制備：參照文獻[6]的方法，對造模組小鼠進行術(shù)前麻醉（異氟醚吸入麻醉），仰臥位固定小鼠，右側(cè)腋窩乙醇消毒后，用一次性無菌注射器皮下注射0.2 mL細胞濃度為1×106/mL的colon-26單細胞懸液，約7 d后，肉眼可見有腫瘤結(jié)節(jié)生成，則小鼠結(jié)腸腺癌動物模型構(gòu)建成功。每日觀察小鼠一般情況（體質(zhì)量、攝食量、活動狀態(tài)等），并做記錄。當造模組小鼠與HC組小鼠對比，出現(xiàn)攝食量減少、體質(zhì)量明顯減輕、精神萎靡、毛色暗雜、行動遲緩等惡病質(zhì)特征時，即結(jié)腸腺癌CC動物模型構(gòu)建成功[7-8]。選取出現(xiàn)CC癥狀的小鼠為結(jié)腸腺癌惡病質(zhì)組（CC組）、未出現(xiàn)CC癥狀的造模組小鼠為腫瘤組（TC組）、HC組各6只進行后續(xù)研究。

1.2.3 樣本采集：建模后第12天，3組小鼠稱取體質(zhì)量后心臟采血，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清，備用。處死小鼠，剝離TC組和CC組的腫瘤組織以及TC組的癌旁組織，并測量每組腫瘤組織的體積。另取3組小鼠腹壁皮下脂肪組織。

1.2.4 qRT-PCR檢測ZAG和脂聯(lián)素的mRNA表達水平：利用Trizol試劑提取腫瘤組織、脂肪組織和血清中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進行qRT-PCR，ZAG和脂聯(lián)素mRNA的表達量以β-actin表達量為內(nèi)參照，按照2-Ct法計算。

1.2.5 Western blot檢測ZAG蛋白表達：取500 mg小鼠腫瘤組織用眼科剪剪成小塊，置于離心管中，加入含1% PMSF的蛋白裂解液2 mL，用勻漿器每次30 s低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1 min，至組織完全裂解，將離心管移至離心機，于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，離心后的上層清亮液分裝至新的離心管中備用。BCA法定量總蛋白后，取等量樣本進行10% SDS-PAGE電泳；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。再用1%脫脂奶粉稀釋一抗，孵育1 h，4 ℃過夜。最后在室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗，得到的蛋白條帶通過ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，拍照。

1.2.6 ELISA檢測ZAG蛋白濃度：將脂肪組織置于含蔗糖、Tris-HCl緩沖液、EDTA以及蛋白酶抑制劑的混合物中勻漿，并離心，棄去脂肪層，利用BCA法定量總蛋白后，用ELISA檢測脂肪組織ZAG的蛋白濃度。

1.2.7 外源性ZAG對CC小鼠體質(zhì)量的影響：pcDNA 3.l（-）-h ZAG質(zhì)粒經(jīng)Eco RV/Hindll III雙酶切后，插入mZAG表達序列連接而成，經(jīng)轉(zhuǎn)染鑒定，可表達鼠源ZAG蛋白。腺病毒骨架質(zhì)粒亦經(jīng)Eco RV/Hindll III雙酶切后，回收Vector DNA，通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至脂肪細胞內(nèi)，經(jīng)PCR鑒定后，進行擴增，純化，制成重組腺病毒（pcDNA-ZAG）。構(gòu)建小鼠結(jié)腸腺癌CC模型（造模方法同上），選取相同條件下喂養(yǎng)，體質(zhì)量相近的小鼠12只，隨機分為2組，每組6只，分別向小鼠右腋皮下注射重組腺病毒（pcDNA-ZAG組）和空載體（pcDNA組），在相同條件下飼喂12 d后，觀察并記錄每組小鼠體質(zhì)量變化，繪制體質(zhì)量變化曲線，并收集相應(yīng)的腫瘤組織，繪制2組小鼠腫瘤體積變化曲線，并檢測ZAG的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計。計量資料采用±s表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，組間比較用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析；并運用Spearmen相關(guān)性分析TC組和CC組脂肪組織ZAG mRNA表達水平與體質(zhì)量減輕值的相關(guān)性以及血清ZAG和脂聯(lián)素mRNA表達水平的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 小鼠一般狀況

圖2 腫瘤組織中ZAG mRNA（A）和蛋白（B）表達水平

2.1 腫瘤組織中ZAG mRNA和蛋白表達水平 CC組建模成功后，小鼠出現(xiàn)明顯食欲不振，體質(zhì)量減輕，見圖1；通過qRT-PCR檢測腫瘤組織中ZAG mRNA的表達水平，結(jié)果表明與癌旁組織相比，TC組和CC組腫瘤組織中ZAG mRNA表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CC組ZAG mRNA表達水平顯著高于TC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A；Western blot檢測結(jié)果也表明，ZAG蛋白表達水平在癌旁組織、TC組腫瘤組織和CC組腫瘤組織中呈現(xiàn)逐漸升高趨勢（P＜0.05），見圖2B。

2.2 脂肪組織中ZAG蛋白濃度和mRNA表達水平 通過ELISA分別檢測HC組、TC組、CC組的脂肪組織中ZAG蛋白濃度，結(jié)果表明，TC組與HC組比ZAG蛋白表達水平顯著升高，CC組與TC組和HC組比ZAG蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A；qRT-PCR檢測結(jié)果也表明3組脂肪組織中ZAG mRNA表達水平變化與蛋白相同（P＜0.05），見圖3B。TC組和CC組的ZAG mRNA與體質(zhì)量減輕值的相關(guān)性分析結(jié)果表明：ZAG mRNA與體質(zhì)量減輕值之間呈正相關(guān)（r=0.96，P＜0.001），見圖4。

圖3 脂肪組織中ZAG蛋白（A）和mRNA（B）表達水平

圖4 脂肪組織ZAG mRNA與體質(zhì)量減輕值的相關(guān)性（n=12）

2.3 血清中ZAG和脂聯(lián)素mRNA表達水平 通過qRTPCR檢測TC組和CC組小鼠血清中ZAG和脂聯(lián)素的mRNA表達水平，結(jié)果表明，TC組和CC組血清中ZAG脂聯(lián)素mRNA表達水平與HC組比升高，CC組與TC組比，血清中ZAG脂聯(lián)素mRNA表達水平也有升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5；相關(guān)分析結(jié)果表明：TC組和CC組小鼠血清中ZAG和脂聯(lián)素的mRNA表達水平呈正相關(guān)（r=0.93，P＜0.001），見圖6。

2.4 外源性ZAG對CC小鼠的體質(zhì)量影響 與pcDNA組比，pcDNA-ZAG組小鼠體質(zhì)量明顯減輕，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7A-B；但腫瘤體積2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7C。

3 討論

CC常以脂肪代謝紊亂為主要特征，包括脂肪分解加快和合成減少，其發(fā)生機制既與腫瘤本身相關(guān)，又與脂肪細胞因子的調(diào)控有關(guān)。近年來，隨著CC致殘率和致死率逐年升高，對其引起的脂代謝異常的研究也受到越來越多的關(guān)注。ZAG是一種新型脂肪細胞因子，它一方面通過激活細胞膜上β3腎上腺素受體，介導(dǎo)胞內(nèi)cAMP信號通路，最后活化激素敏感性脂酶（hormone sensitive lipase，HSL），促進脂肪分解[9]；另一方面，通過提高非酯化脂肪酸（nesterified fatty acid，NEFA）、三酰甘油以及解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCP）的表達，促進脂肪氧化利用[10]。此外，ZAG還可通過抑制前體脂肪細胞分化，抑制脂肪細胞形成[11]。最近研究表明，ZAG能通過調(diào)控其他脂肪細胞因子如脂聯(lián)素、瘦素、TNF-α、IL-6等的表達，調(diào)節(jié)脂肪代謝[12-14]。

本研究通過給小鼠接種colon-26結(jié)腸腺癌細胞株構(gòu)建小鼠結(jié)腸腺癌動物模型和結(jié)腸腺癌CC動物模型，并在此基礎(chǔ)上分離腫瘤組織，觀察CC對ZAG mRNA和蛋白表達水平變化的影響。結(jié)果表明，CC小鼠腫瘤組織中的ZAG mRNA和蛋白表達水平均顯著高于非惡病質(zhì)荷瘤小鼠。相似的研究也在小鼠皮下脂肪組織中展開，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在ZAG mRNA表達水平和蛋白濃度方面，CC小鼠比非惡病質(zhì)荷瘤小鼠顯著增高；同時還發(fā)現(xiàn)，ZAG mRNA表達水平與小鼠體質(zhì)量減輕呈正相關(guān)。上述的研究結(jié)果與BING等[15]的研究成果一致，均表明ZAG在CC體內(nèi)的表達增加與體質(zhì)量減輕密切相關(guān)。

圖5 血清中ZAG（A）和脂聯(lián)素（B）mRNA表達水平

圖6 血清中ZAG和脂聯(lián)素mRNA表達水平的相關(guān)性（n=12）

圖7 外源性ZAG對CC小鼠的體質(zhì)量（A、B）和腫瘤體積（C）的影響

脂聯(lián)素作為脂肪細胞分泌的主要細胞因子之一，可有效降低體循環(huán)中游離脂肪酸和總膽固醇量，在脂肪代謝方面起著重要作用。WELTERS等[14]的研究也證實，敗血癥患者血清中脂聯(lián)素水平與ZAG含量呈正相關(guān)。為此，本研究進一步探究了結(jié)腸腺癌CC小鼠ZAG mRNA表達水平的升高與脂聯(lián)素表達的相關(guān)性，檢測3組小鼠血清中ZAG和脂聯(lián)素的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，CC小鼠的ZAG和脂聯(lián)素的mRNA表達水平均顯著高于非惡病質(zhì)荷瘤小鼠，并且兩者的mRNA表達水平呈正相關(guān)。

為了進一步驗證外源性ZAG是否和腫瘤組織、脂肪組織內(nèi)源性分泌的ZAG一樣均能顯著降低小鼠體質(zhì)量，本研究通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸腺癌CC模型后，在體注射ZAG質(zhì)粒，并對比注射前后的體質(zhì)量及腫瘤體積變化。結(jié)果顯示注射pcDNA-ZAG后未對腫瘤的生長造成顯著影響，但小鼠體質(zhì)量顯著降低，表明外源性ZAG和內(nèi)源性ZAG一樣都有減輕小鼠體質(zhì)量的作用。這一結(jié)果與RESSELL等[16]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，結(jié)腸腺癌CC導(dǎo)致小鼠體內(nèi)分泌的ZAG顯著增加，且ZAG表達水平增加與小鼠體質(zhì)量降低以及血清脂聯(lián)素表達水平升高存在密切聯(lián)系，這也預(yù)示著ZAG在CC患者脂肪代謝中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

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