徐霞芳，童夢琪，蔣倩瑤，趙應征，徐荷林

（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

鹽酸阿霉素（dxoorubicin，DOX）為蒽醌類陽離子型抗腫瘤抗生素，其抗瘤譜廣，已被FDA批準用作多種癌如血癌、乳腺癌、淋巴瘤以及各種軟組織癌治療的一線藥物[1-3]。多療程放化療后，腫瘤耐藥的產(chǎn)生以及劑量依賴的心臟毒性，使該藥物臨床一線應用存在挑戰(zhàn)。雙硫侖又叫做戒酒硫（disulfiram，DSF），為親脂性藥物，能不可逆地抑制乙醛脫氫酶，用于酒精成癮治療已有幾十年。近年來，研究發(fā)現(xiàn)DSF及代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性，能增加耐藥腫瘤細胞對多數(shù)一線化療藥物的敏感性[4-5]。已有多項研究表明DSF既能作用于ROS-MAPK和NF-κB信號通路，對三陰性乳腺癌、乳腺癌干細胞以及腦膠質(zhì)瘤具有抑制作用，又可以永久性滅活腫瘤耐藥相關的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），臨床已被批準用于預防腫瘤耐藥的產(chǎn)生[6-7]。有研究表明DSF作為化學增敏劑與DOX等一線化療藥物聯(lián)合應用，能提高抗腫瘤效果、降低心臟毒性[8]。但DSF口服給藥因在胃腸道或血液中快速降解、穩(wěn)定性差，口服生物利用度低[9-10]。

課題組前期以聚乙二醇單甲醚（monomethoxypolyethylene glycol，mPEG）為親水嵌段、聚乳酸共聚羥基乙酸（poly-D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA）為疏水嵌段，以及聚谷氨酸（poly-L-glutamic acid，PGA）為功能性嵌段，構建了mPEGPLGA-PGA三嵌段聚合物，該聚合物能自發(fā)組裝成納米膠束[11]。該納米膠束中功能性的PGA鏈段能與DOX產(chǎn)生靜電作用，能獲得高達25%載藥量和良好的載藥穩(wěn)定性，在10%血漿蛋白中藥物滲漏率小于20%[12]。在此基礎上，本研究以DSF作為化學增敏劑與PLGA經(jīng)疏水作用，與DOX共同擔載在mPEG-PLGAPGA納米膠束內(nèi)，制備了雙載藥納米膠束，對雙載藥納米膠束進行了體外表征和體外抗腫瘤效果的評價。

1 材料和儀器

1.1 材料 mPEG-PLGA-PGA（鏈段相對分子質(zhì)量：mPEG，5.0 kDa；PLGA，20 kDa；PGA，7.9 kDa，實驗室合成）；DSF（日本和光株式會社）；DOX（98%，北京華奉聯(lián)博科技有限公司）；人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶購自美國GIBCO公司；MTT、DAPI試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 儀器 VirTis ES-53冷凍干燥機（美國VirTis公司），JEOLJEM-2000EX透射電鏡（日本JEOL公司），SpectraMax M3酶標儀（美國十字MD公司），NICOMPTM 380粒度測定儀（美國Nicomp公司），DSC1差示掃描量熱儀（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法

2.1 雙載藥納米膠束的制備 稱取5～15 mg DSF以及100～300 mg三嵌段mPEG-PLGA-PGA聚合物，溶于6 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，磁力攪拌使其完全溶解，作為有機相；在劇烈攪拌下，將4 mL DOX水溶液緩慢滴入至有機相中（約30 min），室溫避光繼續(xù)攪拌30 min，混合均勻，將混勻后液體轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)（透析膜截留相對分子質(zhì)量為3.5 kDa），對蒸餾水透析24 h，開始每隔2 h換水1次、后每隔10 h換水1次，除去有機溶劑，12 000 r/min離心除去藥物沉淀，得上清液，即為雙載藥納米膠束（DSFDOX-NPs）。控制雙載藥納米膠束制備過程中DSF/DOX的質(zhì)量投料比為1∶1和總投藥質(zhì)量與聚合物投料質(zhì)量比為1∶20，考察總投藥量（5、10、15 mg）以及聚合物投料量對載藥納米膠束的包封率和粒徑的影響。

2.2 雙載藥納米膠束的質(zhì)量評價

2.2.1 載藥量及包封率測定：取100 μL載藥納米膠束至5 mL容量瓶中，加入乙腈，超聲破壞膠束，乙腈定容至刻度，過0.8 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，進樣10 μL，HPLC測定（日立L-2130泵，L-2400紫外檢測器）。HPLC條件：Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為：乙腈-水（60∶40，v/v）；流速1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫25 ℃。按照下列公式計算載藥量及包封率：

2.2.2 雙載藥納米膠束的表征：動態(tài)光散射激光粒度測定儀（dynamic light scattering，DLS）測定納米膠束粒徑和Zeta電位，聚合物納米粒水溶液，過0.8 μm膜，經(jīng)適當稀釋后，于常溫條件下固定激光波長為632.8 nm、散射角90°，NICOMPTM 380粒度測定儀測定粒徑和Zeta電位；透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測納米膠束形態(tài)，取雙載藥納米膠束滴于鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，以無纖維濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余液體，滴入2%磷鎢酸染色，自然晾干2 d，置于TEM中以100 kV加速電壓檢視、拍照；差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析藥物存在狀態(tài)，取適量的2種游離藥物混合物（質(zhì)量比為1∶1）、空白納米膠束凍干品、雙載藥納米膠束凍干品、空白納米膠束凍干品與兩種藥物的物理混合物，進行DSC分析，起始溫度-30 ℃，升溫速度5 ℃/min，終止溫度300 ℃。

2.2.3 雙載藥納米膠束體外釋放：取雙載藥納米膠束至透析袋內(nèi)（截留分子量為3 500 Da），扎緊密封兩端，放置在含有1% SDS的pH7.4 PBS釋放介質(zhì)中，置水浴搖床于37 ℃，100 r/min震搖，不同時間取1 mL釋放介質(zhì)，按照2.2.1所述HPLC方法同時測定DSF和DOX的濃度，計算累積釋放百分數(shù)，繪制釋放曲線。以DOX與5% SDS增溶的DSF混合制成溶液劑作為對照，同法進行體外釋放實驗。

2.3 雙載藥納米膠束的體外細胞毒性

2.3.1 人乳腺癌細胞的培養(yǎng)：人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR培養(yǎng)至第四代后使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，加入1 μg/mL DOX維持細胞耐藥性，實驗前2周停藥。待培養(yǎng)皿細胞融合率達85%，0.25%胰酶至培養(yǎng)箱中消化1 min，進行傳代培養(yǎng)。

2.3.2 MTT法細胞毒性實驗：對數(shù)生長期的細胞消化后，用培養(yǎng)液稀釋至8×103個/mL細胞密度，吹打后以100 μL/每孔將細胞懸液接種在96孔板中，將96孔板置細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h使細胞貼壁。待貼壁后，加入100 μL含有游離藥物或載藥納米膠束的新鮮培養(yǎng)介質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將96孔板取出，加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后甩板，除去培養(yǎng)介質(zhì)。將96孔板倒扣在濾紙上充分吸干殘留培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO于震蕩器上震搖10 min溶解甲瓚，酶標儀測定492 nm處吸光度。同時加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)介質(zhì)作為對照組（control），每組設定3個復孔。按照如下公式計算細胞存活率（%）。以改良寇氏計算法計算抑制50%細胞生長時的藥物濃度，即IC50值。Atest為測試組的吸光度，Acontrol為對照組的吸光度

2.3.3 細胞攝取實驗：MCF-7/ADR細胞以1×105個/mL密度，接種200 μL在96孔板中，置細胞培養(yǎng)箱孵育24 h使細胞貼壁后，移去培養(yǎng)液，加入200 μL含有游離藥物或載藥納米膠束的細胞培養(yǎng)液（相當于10 μg/mL DOX），繼續(xù)置細胞培養(yǎng)箱孵育1 h或4 h。移去含藥細胞培養(yǎng)液，加入4 ℃的PBS終止細胞攝取，PBS沖洗細胞3次，4%低聚甲醛固定細胞20 min，PBS沖洗3次，加入100 μL DAPI試劑，避光染色細胞核5 min，PBS沖洗3次，加入70 μL 50%甘油封閉細胞，將96板置ImageXpress Micro寬場成像高內(nèi)涵成像儀拍照。

2.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 雙載藥納米膠束處方優(yōu)化 透析法為制備嵌段聚合物納米膠束的經(jīng)典方法，該方法制備的納米膠束理化性質(zhì)如粒徑、形態(tài)以及載藥量和包封率等容易受處方和工藝因素的影響。通過固定制備工藝，考察不同嵌段聚合物以及總藥物量對載藥納米膠束的載藥量、包封率以及粒徑的影響，結(jié)果表明，控制DSF/DOX的質(zhì)量比為1∶1，總藥物量為10 mg時，隨著聚合物濃度增加，2種藥物載藥量均有降低，而兩藥包封率則均有提高，尤其是DSF包封率提高更明顯，DOX包封率稍有提高均在90%以上，表明DOX相比DSF較容易裝載在納米膠束內(nèi)（見表1）。這是因為三嵌段mPEG-PLGA-PGA聚合物中的PLGA側(cè)鏈羧基，與陽離子型DOX間存在強靜電作用，而DSF與PLGA鏈間僅有微弱的疏水作用。相似，固定聚合物投料為200 mg，考察總藥物投料量的影響，結(jié)果表明隨總藥物投料量增大，DOX載藥量增大，包封率均在90%以上；而DSF載藥量則先增大后減小，在投料量為10 mg時，載藥最高（為1.91%），包封率則隨著總藥物投料量增大而降低，進一步證明DSF難以裝載的結(jié)論，這與文獻報道[13]的PLGA類嵌段聚合物對DSF載藥難以達到5%結(jié)果一致。聚合物投料量對納米膠束粒徑具有更大的影響，隨著聚合物投料量增大，載藥納米粒粒徑增大，尤其是當聚合物投料量增至300 mg時，納米膠束粒徑最大。而總藥物量對粒徑增大的影響較小，所有載藥納米膠束粒徑均在80～125 nm間。見表1。綜上分析，選擇聚合物投料量200 mg，DSF/DOX的質(zhì)量比為1∶1，總藥物量為10 mg時制備雙載藥納米膠束，其粒徑，各個藥物載藥量、包封率均較高。同時，以單一藥物量為5 mg，聚合物量為200 mg，制備單載藥納米膠束（DSF-NPs或DOX-NPs）作為后續(xù)細胞實驗的對照研究，其載藥量、包封率見表2。

表1 聚合物和藥物投料量對納米膠束載藥量、包封率以及粒徑的影響（n=3，±s）

表1 聚合物和藥物投料量對納米膠束載藥量、包封率以及粒徑的影響（n=3，±s）

聚合物量 100 2.61±0.12 57.73±2.32 4.31±0.14 95.66±3.35 56.2±0.2 200 1.81±0.04 72.94±3.45 2.28±0.11 95.80±2.15 102.1±0.1 300 1.42±0.03 87.86±2.76 1.61±0.13 96.85±1.36 380.7±0.3總藥物量 5 1.14±0.05 90.90±4.21 1.18±0.07 96.76±1.23 87.2±0.1 10 1.91±0.13 80.30±1.82 2.29±0.19 96.21±1.34 103.4±0.3 15 1.84±0.21 51.79±2.68 6.61±0.33 94.51±2.36 121.5±0.2

表2 優(yōu)化后的載藥納米膠束的載藥量和包封率（n=3±s，%）

表2 優(yōu)化后的載藥納米膠束的載藥量和包封率（n=3±s，%）

注：a為DSF的載藥量和包封率，b為DOX的載藥量和包封率

DSF-NPs 1.87±0.41 76.91±2.56 DOX-NPs 2.28±0.34 95.00±1.89 DSFDOX-NPs 1.91±0.19a 80.30±1.31a 2.28±0.12b 96.20±3.24b

3.2 雙載藥納米膠束的表征

3.2.1 雙載藥納米膠束粒徑和Zeta電位：以最佳處方制備空白納米膠束（Blank NPs）、單載藥納米膠束（DOX-NPs和DSF-NPs）以及雙載藥納米膠束（DSFDOX-NPs），DLS分別測定其粒徑和Zeta電位結(jié)果。空白納米膠束平均粒徑為（211.2±1.3）nm，Zeta電位為（-25.4±0.2）mV，DOX裝載對納米膠束粒徑和Zeta電位有顯著的影響，DOX裝載后納米膠束粒徑減小，Zeta電位增大，DOX-NPs粒徑減小至（102.1±0.4）nm，Zeta電位增大至（-14.5±0.1）mV，而DSFDOXNPs粒徑減小為（107.5±0.2）nm，呈現(xiàn)窄的粒徑分布（見圖1A），Zeta電位增大為（-13.7±0.1）mV；這是因為空白納米膠束中PGA側(cè)鏈羧基解離、相互排斥，使得納米膠束粒子呈現(xiàn)高度水化膨脹狀態(tài)，而載藥后因DOX與PGA側(cè)鏈靜電作用，形成疏水性復合物，使得納米粒子收縮，粒徑變小，Zeta電位增大。而DSF裝載對納米膠束粒徑和Zeta電位沒有明顯的影響，與空白納米膠束相比，因DSF的裝載，DSF-NPs粒徑稍有增大，粒徑為（228.5±1.5）nm，Zeta電位則基本不變，為（-23.8±0.3）mV，符合納米膠束靜脈注射給藥的要求。

3.2.2 雙載藥納米膠束形態(tài)：TEM為研究納米膠束形態(tài)的可靠手段，以2%磷鎢酸負染，TEM觀察納米膠束形態(tài)的結(jié)果表明，雙載藥納米膠束呈白色的球形粒子且分布均勻，TEM測量的粒徑為95 nm，比DLS測定的水合直徑（Dh）稍有偏低，這是因為TEM測定前需對樣品進行干燥、脫水和抽真空等處理，使載藥納米膠束PEG水化層皺縮，納米膠束粒徑縮小[14]。見圖1B。

3.2.3 雙載藥納米膠束藥物分布狀態(tài)：DSC分析結(jié)果表明，DOX原料藥在218 ℃處，DSF原料藥物在71.2 ℃處，出現(xiàn)明顯的吸熱峰，分別為其晶體熔點峰；嵌段聚合物在58.6 ℃出現(xiàn)了PLGA鏈相關的寬吸熱峰，為其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度（Tg）；物理混合物分別出現(xiàn)了藥物與聚合物相關的吸熱峰；而在雙載藥納米膠束DSC曲線中，藥物相關吸熱峰消失，僅在58.5 ℃出現(xiàn)PLGA鏈相關的寬吸熱峰，表明DOX和DSF以無定型均勻分布在納米粒中。見圖2。

3.3 體外藥物釋放 在pH7.4條件下，DSF和DOX從溶液劑和雙載藥納米膠束制劑中釋放曲線表明，DSF和DOX從納米膠束制劑中釋放的速率均比溶液劑緩慢，溶液劑中DSF在12 h內(nèi)釋放達98%，DOX則在6 h釋放完全，而納米膠束制劑中DSF延長至48 h釋放才到85%，DOX則即使釋放72 h才72%，表明納米膠束延緩DOX的釋放能強于DSF（見圖3）。這可能是因為納米膠束中PGA鏈與DOX間的靜電作用強于PLGA鏈與DSF間的疏水作用。這種對兩種不同作用機制的藥物“級聯(lián)式”釋放模式可能更符合實際治療的需要，如對耐藥性腫瘤的治療往往需要P-gp抑制劑先釋放，增加后釋放的化療藥物細胞內(nèi)藥物濃度[15]。

圖1 DOXDSF-NPs的粒徑分布（A）和TEM形態(tài)觀察（B，×30 000）

圖2 DOX、DSF、DSF+DOX+Polymer物理混合物（含1.81% DSF和2.18% DOX）、雙載藥納米膠束凍干粉末（DSFDOX-NPs，含1.91% DSF和2.28% DOX）和mPEGPLGA-PGA聚合物的DSC曲線

圖3 在pH7.4 PBS中，DSF 和DOX分別從溶液劑和雙載藥納米膠束制劑中的釋放曲線

3.4 細胞毒性和細胞攝取 前期研究已證明人乳腺癌MCF-7/ADR為DOX超級耐藥的細胞[16]，因此選擇該細胞株。本研究比較了DOX溶液劑（DOXSolution）、單載藥納米膠束制劑（DOX-NPs或DSFNPs）和雙載藥納米膠束制劑（DSFDOX-NPs）的細胞生長抑制作用。結(jié)果表明，DSF-NPs組在整個測試濃度范圍內(nèi)無明顯細胞毒性，細胞存活率大于80%；DOXSolution僅在高濃度才時展現(xiàn)出細胞增殖抑制作用，DOX-NPs能顯著提高MCF-7/ADR細胞對DOX的敏感性，而DSFDOX-NPs對MCF-7/ADR細胞毒性呈明顯的濃度依耐性，并且DSFDOX-NPs在不同DOX濃度（10、50、100 μg/mL）下的細胞抑制率都明顯高于DOX-NPs和DOX-Solution，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中DOX-Solution IC50為188.56 μg/mL；DOX-NPs其IC50為42.42 μg/mL，降低為DOX-Solution IC50值的22.5%；DSFDOX-NPs其IC50為15.32 μg/mL，降低為DOX-Solution IC50值的8.12%，降低為DOX-NPs IC50值的36.1%（見圖4）。MCF-7/ADR耐藥細胞，P-gp在過度表達，進入細胞膜或已進入細胞質(zhì)的游離藥物能被其識別、泵出細胞，使得到達藥物靶點部位的藥物濃度降低，因而出現(xiàn)DOX-Solution較低的毒性。相反，包裹在聚合物納米膠束中的DOX，則可能以內(nèi)吞機制進入細胞，繞開了細胞膜外排蛋白的直接識別[13]。但不排除有部分包裹的DOX在細胞吞噬之前從納米膠束中釋放，由于P-gp的外排作用無法進入細胞，而DSFDOX-NPs則能先釋放DSF抑制P-gp，使更多的DOX進入細胞核，具有更強的細胞毒性[15]。

在DOX濃度為10 μg/mL時，MCF-7/ADR細胞與DOX-Solution、DOX-NPs以及DSFDOX-NPs孵育4 h后，DOX-Solution由于細胞跨膜P-gp的外排作用，僅有少量的藥物分布在細胞膜；而DOX-NPs則有一定量的藥物分布在細胞核中；相比之下，DSFDOX-NPs則在細胞核和細胞質(zhì)中均有更多的藥物分布，這種細胞內(nèi)高濃度藥物聚集與其較強的細胞毒性結(jié)果相一致（見圖5）。

圖4 載藥納米膠束對MCF-7/ADR細胞的毒性

圖5 MCF-7/ADR細胞對各載藥納米膠束攝取圖（×200）

綜上所述，本研究利用新型三嵌段聚合物mPEG-PLGA-PGA結(jié)構特點，實現(xiàn)對疏水性的DSF和親水性的DOX共同裝載，構建了雙重載藥納米膠束，初步探索其對耐藥腫瘤細胞的抑制效果。結(jié)果表明該嵌段聚合物膠束能實現(xiàn)DSF和DOX的共同裝載，但對DOX的載藥效率高于DSF，可以通過控制聚合物與藥物投料控制雙載藥納米膠束的理化性質(zhì)。雙載藥納米膠束均能延緩兩種藥物的釋放，呈現(xiàn)DSF快釋放，DOX慢釋放的“級聯(lián)式”釋放模式。這種藥物釋放模式更符合實際治療的需要，對耐藥性腫瘤的治療往往需要P-gp抑制劑先釋放，增加后釋放的化療藥物細胞內(nèi)藥物濃度[15-17]。細胞毒性和細胞攝取實驗表明DSF作為P-gp抑制劑，先從納米膠束中釋放，能顯著地增加后釋放的DOX在耐藥細胞中的濃度，使雙載藥納米膠束高效地逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞對DOX的耐藥。為了進一步確定該雙載藥納米膠束對動物模型的效果，需要進行體內(nèi)藥動學以及藥效學的研究。

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