王國(guó)強(qiáng)，路文華，常 娟，尹清強(qiáng)*，劉超齊，王二柱，盧富山

（1.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南南陽473000；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；3. 河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；4. 河南普愛飼料股份有限公司，河南周口466000）

據(jù)報(bào)道，全國(guó)畜禽糞便年產(chǎn)量約為19億t，是工業(yè)固體廢棄物產(chǎn)量的2.4倍，加上污水年排放量高達(dá)60多億t[1]，已成為我國(guó)最大的污染源。如果畜禽糞便得不到及時(shí)且合理的處理，會(huì)污染環(huán)境，孽生蚊蠅，病原菌種類增多，使病原菌和寄生蟲大量繁殖，最終導(dǎo)致畜禽傳染病和寄生蟲病的發(fā)生，影響畜禽生產(chǎn)[2-4]。畜禽糞便的無害化處理主要有物理、化學(xué)與生物處理3種方法。物理處理方法存在處理過程耗時(shí)長(zhǎng)和產(chǎn)生氨氣等臭氣及生產(chǎn)設(shè)備投資大、耗能高、排出的氣體易造成二次污染等缺點(diǎn)[5-6]?；瘜W(xué)方法因效果不穩(wěn)定、易產(chǎn)生二次環(huán)境污染，使得該技術(shù)無法推廣應(yīng)用。生物方法不僅具有肥效高、成本低和效果好等特點(diǎn)，而且還具有滅菌與除臭的功效，是目前常用的一種較為合理的無害化處理方法[7]。周可等[8]試驗(yàn)表明，當(dāng)采用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單孢菌混合菌劑，按0.2%接種時(shí)，雞糞發(fā)酵溫度上升快、腐熟快、病原菌數(shù)量降低明顯。石星群[9]選用3株地衣芽孢桿菌和2株枯草芽孢桿菌等比例混合，按1%接種發(fā)酵雞糞13 d后，雞糞中的氨氮含量由1 241 mg/kg下降至335 mg/kg，其發(fā)酵結(jié)果要優(yōu)于單一菌株發(fā)酵。由此可見，利用匹配良好的多種微生物發(fā)酵雞糞的效果要優(yōu)于品種少的微生物發(fā)酵，且配比合適將會(huì)發(fā)揮復(fù)合菌各自的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。但目前對(duì)于多種微生物在發(fā)酵糞便過程中協(xié)同作用的研究較少。本研究利用響應(yīng)面回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，探索多種微生物在處理畜禽糞便中的協(xié)同功效，為畜禽糞便的無害化處理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基 試驗(yàn)選用的干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、糞腸球菌及枯草芽孢桿菌均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，并由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)研究室保存。

培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min備用；固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。枯草芽孢桿菌經(jīng)過LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選純化之后，接種至LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、200 r/min，培養(yǎng)24 h，最后把所得的枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)調(diào)整為1.0×109CFU/mL。糞便中總菌數(shù)的測(cè)定也選用LB固態(tài)培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)48 h，其菌落形成數(shù)（CFU）用自然對(duì)數(shù)（lg）表示。

培養(yǎng)干酪乳桿菌和糞腸球菌的MRS液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g，酵母浸出物10 g，葡萄糖20 g、吐溫-80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉2 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min備用；固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。干酪乳桿菌和糞腸球菌分別經(jīng)過MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選純化之后，分別接種至MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、靜置培養(yǎng)24 h，最后把所得的干酪乳桿菌和糞腸球菌的有效活菌數(shù)糞便調(diào)整為1.0×109CFU/mL。

培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母的YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸出物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min備用；固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)過YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選純化之后，接種至YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃、200 r/min，培養(yǎng)24 h，最后把所得的產(chǎn)朊假絲酵母有效活菌數(shù)調(diào)整為1.0×109CFU/mL。

培養(yǎng)大腸桿菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：（EMB，北京奧博星）：稱取EMB 42.5 g，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、0.15 MPa高壓蒸汽滅菌20 min備用。培養(yǎng)條件為37℃、靜置培養(yǎng)48 h。

1.2 單因素試驗(yàn) 枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和糞腸球菌皆進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別按0、0.05%、0.1%、0.5%和1%接種（用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋到同等體積）。首先測(cè)定雞排泄物中含水量為69.69%，采用250 mL錐形瓶，取樣量為200 g，按上述比例接種微生物，在37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h后取樣測(cè)含水量、干物質(zhì)、總活菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、pH、氮和吲哚含量等指標(biāo)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 相關(guān)指標(biāo)及測(cè)定方法 含水量的測(cè)定采用GB/T6435-2014《飼料中水分的測(cè)定》；總活菌數(shù)的測(cè)定采用LB瓊脂平板涂布法；大腸桿菌數(shù)的測(cè)定用伊紅美藍(lán)平板涂布法；pH檢測(cè)采用pH S-2C酸度計(jì)（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器）；氮含量測(cè)定采用GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》；雞糞發(fā)酵溫度的測(cè)定采用溫度計(jì)測(cè)定。

吲哚含量的測(cè)定首先要準(zhǔn)備吲哚乙酸（IAA）標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/mL)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取樣品10 g裝入錐形瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液40 mL，于100℃水浴中煮沸15 min(上面加蓋防止水分蒸干)，取出后再向其內(nèi)加入0.1 mol/L NaOH溶液25 mL，充分搖勻，用甲醇定容至100 mL，靜置30 min，取上清液在3000 r/min下離心30 min，上清液即為樣品提取液。取試管3支，依次各加入上述樣品提取液2 mL和試劑A（0.5 mol/L FeCl3溶液15 mL、濃H2SO4（比重1.84）300 mL，蒸餾水500 mL，于使用前混合均勻，避光保存）8 mL，于40℃溫箱中顯色30 min，在530 nm下比色（以雙蒸水調(diào)零），記錄OD值。

樣品中吲哚含量（mg/g）=（A×V1)/（W×V2）式中，A為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的IAA的量（mg），V1為樣品提取液體積（mL），W為樣品重量（g），V2為樣品反應(yīng)液體積（mL）。

1.4 復(fù)合菌的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇干酪乳桿菌0.05%、產(chǎn)朊假絲酵母0.1%、糞腸球菌0.05%、枯草芽孢桿菌0.05%，分別作為4種菌的中心水平（設(shè)定為0水平），采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)（1、0、-1），以獲得4種菌的最優(yōu)組合。微生物發(fā)酵等操作流程與單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05表示差異顯著。通過Design-expert方差分析來驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的差異顯著度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 動(dòng)物排泄物理想的微生物發(fā)酵狀態(tài)應(yīng)體現(xiàn)在低接種量，以及發(fā)酵終產(chǎn)物中含有較低的活菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、干物質(zhì)損失率和吲哚含量，較高的發(fā)酵溫度和氮含量。本研究以吲哚含量和接種量作為2個(gè)重要考核指標(biāo)確定各菌劑的適宜添加量。從表1可以看出，干酪乳桿菌單因素指標(biāo)中，溫度、氮含量、總活菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、干物質(zhì)損失率和吲哚含量在對(duì)照組和各試驗(yàn)組差異顯著（P＜0.05）。干酪乳桿菌添加量為0.05%較為合適。

由表2可知，產(chǎn)朊假絲酵母添加量為0.1%時(shí)，溫度最高、吲哚含量和總菌數(shù)最低（P＜0.05），添加量為0.5%時(shí)大腸桿菌數(shù)和干物質(zhì)損失率最低（P＜0.05）。產(chǎn)朊假絲酵母添加量為0.1%較為合適。

從表3可以看出，糞腸球菌添加量在0.05%時(shí)溫度最高、干物質(zhì)損失率最低，而且吲哚含量和大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。因而，糞腸球菌的適宜添加量為0.05%。另外，隨著糞腸球菌添加量的提高，相關(guān)指標(biāo)有不同的改善。

由表4可知，當(dāng)枯草芽孢桿菌添加量在0.05%時(shí)，吲哚含量、干物質(zhì)損失率和總菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）?？莶菅挎邨U菌的適宜添加量為0.05%。

2.2 最優(yōu)復(fù)合菌的響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)

2.2.1 回歸方程的建立及復(fù)合益生菌最佳配比的確定綜合考慮單因素試驗(yàn)的結(jié)果，將0.05%干酪乳桿菌、0.05%糞腸球菌、0.10%產(chǎn)朊假絲酵母和0.05%枯草芽孢桿菌，分別設(shè)定為A、B、C、D 4個(gè)因素的零水平，進(jìn)行響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平編碼（1、0、-1）和結(jié)果見表5，把吲哚含量作為響應(yīng)值Y。得到回歸方程：

通過對(duì)回歸方程求最佳解，得到4種菌的最佳配比，即干酪乳桿菌0.06%、糞腸球菌0.07%、產(chǎn)朊假絲酵母0.15%、枯草芽孢桿菌0.07%，此時(shí)的吲哚含量最低。通過對(duì)響應(yīng)面回歸方程系數(shù)的方差分析結(jié)果可知，模型Prob＞F值小于0.01，表明該模型可信度高。

表1 干酪乳桿菌發(fā)酵雞糞的單因素試驗(yàn)

表2 產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵雞糞的單因素試驗(yàn)

表3 糞腸球菌發(fā)酵雞糞的單因素試驗(yàn)

2.2.2 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)雞糞的發(fā)酵結(jié)果 從表6可知，利用最佳配比的復(fù)合益生菌發(fā)酵雞糞，使雞糞中的吲哚含量、大腸桿菌數(shù)量和pH分別比對(duì)照組降低了87.50%、21.93%和16.72%（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵雞糞的單因素試驗(yàn)

表5 響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表6 復(fù)合微生物制劑發(fā)酵雞糞中pH、吲哚含量和大腸桿菌數(shù)量的變化(n=6)

3 討 論

大量研究發(fā)現(xiàn)，畜禽糞便微生物發(fā)酵是最有效的無害化處理和資源化利用方法[10]。關(guān)于單一微生物發(fā)酵畜禽糞便的研究，Anderson等[11]研究發(fā)現(xiàn)，利用干酪乳桿菌對(duì)糞便進(jìn)行發(fā)酵可顯著降低大腸桿菌數(shù)量；楊恕玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌和乳酸菌皆可提高雞糞發(fā)酵溫度，顯著降低大腸桿菌數(shù)量和臭味；胡佩[13]用細(xì)黃鏈霉菌在30℃處理雞糞，臭味物質(zhì)濃度比對(duì)照組降低70%；姚軍虎等[14]運(yùn)用加藤菌發(fā)酵雞糞便，取得了較好的效果。本研究結(jié)果表明，單一的乳酸桿菌發(fā)酵雞糞的效果最佳，可顯著降低吲哚和大腸桿菌含量，并提高發(fā)酵溫度；其他3種菌的發(fā)酵效果依次為枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和糞腸球菌，與前人結(jié)果一致。微生物發(fā)酵動(dòng)物糞便可降低臭味，主要是由于微生物對(duì)吲哚等臭味物質(zhì)的分解作用及合成的抑制作用。微生物發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的細(xì)菌素和發(fā)酵熱可能是降低大腸桿菌數(shù)量的主要原因。

利用復(fù)合微生物發(fā)酵畜禽糞便的效果要優(yōu)于單一菌種[8,15-18]，這主要是由于微生物之間存在著良好的協(xié)同關(guān)系。每一種微生物皆具有各自獨(dú)特的繁殖特性和發(fā)酵功能。例如，乳酸桿菌和糞腸球菌屬于兼性厭氧菌，可產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)和細(xì)菌素，可以競(jìng)爭(zhēng)性地排斥或抑制糞便中大腸桿菌等病原菌的繁殖，起到降低臭味和殺滅病原菌的作用；酵母菌屬于需氧菌，有利于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的合理轉(zhuǎn)化，減少蛋白質(zhì)向氨（胺）轉(zhuǎn)化，降低臭味物質(zhì)的合成；枯草芽孢桿菌屬于需氧菌，可產(chǎn)生大量的發(fā)酵熱，有利于殺滅大量的病原菌。本研究結(jié)果表明，當(dāng)干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌分別以0.06%、0.15%、0.07%、0.07%的接種量來發(fā)酵雞糞時(shí)，可使糞便中吲哚和大腸桿菌含量及pH得到大幅度降低，取得了比較滿意的效果。此外，利用復(fù)合微生物發(fā)酵畜禽糞便可生產(chǎn)出高品質(zhì)有機(jī)肥，達(dá)到減少環(huán)境污染及合理利用資源目的[19-20]。本研究為畜禽糞便的無害化處理提供了一種新的復(fù)合微生物發(fā)酵劑。

4 結(jié) 論

本研究通過單因素及多因素響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，得到了畜禽糞便無害化處理的復(fù)合微生態(tài)制劑的配比為：干酪乳桿菌0.06%、產(chǎn)朊假絲酵母0.15%、糞腸球菌0.07%、枯草芽孢桿菌0.07%。通過微生物發(fā)酵使畜禽糞便中的臭味和有害微生物含量大幅度降低，對(duì)于消除養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境的污染具有重要意義。

[1] 晉美加措, 陳芳芳, 旺堆. 西藏規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場(chǎng)糞污處理的設(shè)想[J]. 中國(guó)畜牧業(yè), 2015(12): 40-41.

[2] Takuya Y. Method for preventing malodor from livestock manure by utilization of refuse-derived solid fuels[J]. Fuel Energy Abstr, 2003, 44(4): 271.

[3] Chi FH, Lin PHP, Leu MH. Quick determination of malodorcausing fatty acid in manure by capillary electrophoresis[J].Chemosphere, 2005, 60: 1262-1269.

[4] Willig S, Lacorn M, Claus R. Development of a rapid and accurate method for the determination of key compounds of pig odor[J]. J Chromatogr A, 2004, 1038: 11-18.

[5] 常志州, 朱萬寶, 葉小梅, 等. 畜禽糞便除臭及生物干燥技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)村生態(tài)環(huán)境, 2000, 16(1): 41-43.

[6] 劉輝, 王凌云, 劉忠珍, 等. 我國(guó)畜禽糞便污染現(xiàn)狀與治理對(duì)策[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010 (6): 213-216.

[7] 汪植三, 李其謙, 廖新, 等. 畜禽糞便污水及廢氣凈化的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 1995, 11(4): 90-95.

[8] 周可, 謝鳳行, 李亞玲. 不同微生物菌劑處理對(duì)雞糞堆肥發(fā)酵的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 15(3): 10-13.

[9] 石星群. 復(fù)合微生物菌劑在雞糞發(fā)酵中的研究[D]. 沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[10] 吳淑杭, 姜震方, 俞清英. 禽畜糞堆肥化技術(shù)進(jìn)展[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2003, 19 (l): 50-52.

[11] Anderson C, Malambo DH, Perez MEG,et al. Lactic acid fermentation, urea and lime addition: Promising faecal sludge sanitizing methods for emergency sanitation[J]. Int J Environ Res Public Health, 2015, 12: 13871-13875.

[12] 楊恕玲, 侯麗鵬, 翟玉蕊, 等. 菌種和輔料對(duì)雞糞堆肥效果的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(24): 56-60.

[13] 胡佩. 家禽糞便的微生物除臭法[J]. 土壤肥料, 1996,16(4): 45-46.

[14] 姚軍虎, 張長(zhǎng)青, 鄧留坤, 等. 加藤菌對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能及雞蛋品質(zhì)的影響[J]. 飼料研究, 2000, 10(4): 10-12.

[15] Weiland P. Anaerobic waste digestion in Germany-Status and recent developments[J]. Biodegradation, 2000, 11: 415-421.

[16] 胡尚勤. 微生物除臭牛糞的初步研究[J]. 重慶環(huán)境科學(xué),1994, 16(1): 9-11.

[17] 劉強(qiáng), 梁雷, 陳忠林, 等. 復(fù)合菌劑接種雞糞堆肥的效應(yīng)研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(6): 5-8.

[18] 許曉英, 李季. 復(fù)合微生物菌劑在污泥高溫好氧堆肥中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 14(3): 64-66.

[19] 焦喜蘭, 李瑞鋒, 梁宏德, 等. 益生素對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、腸道菌群和部分免疫性能的影響[J]. 飼料博覽, 2013(3):20-23.

[20] 楊紅初, 紀(jì)孫瑞, 龔月生, 等. 益生菌的研究進(jìn)展及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 飼料博覽(技術(shù)版), 2008(5): 4-7.