王惠云，廖 滿，王 蕾，趙 迪，易 丹 ，劉玉蘭，丁斌鷹

（動(dòng)物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

冷應(yīng)激對(duì)家禽的健康養(yǎng)殖會(huì)造成許多不良影響，如飼料攝入量和基礎(chǔ)代謝率增加，生產(chǎn)性能降低[1]；降低肉雛雞抵抗力，提高發(fā)病率與死亡率[2]；誘導(dǎo)機(jī)體氧化，增加體內(nèi)自由基含量，使機(jī)體損傷[1]；提高基礎(chǔ)代謝率，使能量損耗增加[3]；嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致腹水，提高死亡率?；谑称钒踩目紤]，研究冷應(yīng)激肉雞的營養(yǎng)調(diào)控措施對(duì)家禽健康養(yǎng)殖具有重要意義。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）為硫醇類化合物，是L-半胱氨酸與還原型谷胱甘肽（GSH）的前體物[4]。GSH具備較強(qiáng)清除活性氧自由基[5]、提高機(jī)體能量的作用，與其前體物NAC可有效改善腸道屏障功能[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.05%NAC可緩解脂多糖（LPS）刺激致使仔豬腸黏膜損傷、能量過度損耗與小腸吸收功能降低等情況[7]。NAC還可緩解黃曲霉毒素對(duì)肉雞的毒害作用[8]，提高肉鴨抗氧化能力并改善能量代謝水平[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明，日糧中添加0.1%NAC可改善熱應(yīng)激狀態(tài)下肉雞的生產(chǎn)性能與腸道功能[10]。但關(guān)于NAC在冷應(yīng)激肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用還未見報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)旨在研究NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞腸道組織形態(tài)、能量代謝狀況與抗氧化能力的影響，不僅可進(jìn)一步探索肉雞在冷應(yīng)激情況下腸道功能的變化，還可為NAC在肉雞生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為探尋緩解肉雞冷應(yīng)激的營養(yǎng)途徑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)日糧 NAC純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司?；A(chǔ)日糧參照中國肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制，采用玉米-豆粕型日糧，日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧和營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用2×2設(shè)計(jì)，按體重相近原則隨機(jī)將200只1日齡、體重為（45±0.5）g、健康雄性科寶肉雞分為4個(gè)組（對(duì)照組、冷應(yīng)激組、NAC組、冷應(yīng)激+NAC組），每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。對(duì)照組與冷應(yīng)激組飼喂基礎(chǔ)日糧，NAC組與冷應(yīng)激+NAC組飼喂含0.1%NAC的基礎(chǔ)日糧。NAC添加劑量的選擇依據(jù)課題組前期的研究結(jié)果[10]。由于日糧中添加0.1% NAC只增加了0.0084%氮，故忽略不計(jì)[10]。試驗(yàn)期42 d。

1.3 飼養(yǎng)管理 肉雞飼養(yǎng)采用網(wǎng)上平養(yǎng)，每籠10只。試驗(yàn)前，對(duì)料槽、雞籠、雞舍與飲水器等清掃消毒，并對(duì)雞舍采取熏蒸方式消毒。新城疫疫苗于試驗(yàn)第7、21天接種，法氏囊疫苗于試驗(yàn)第14、28天接種。自由采食與飲水，24 h光照并定期打掃與消毒。參照廖滿等[11]方法對(duì)溫度進(jìn)行控制：試驗(yàn)第1～2周按常規(guī)飼養(yǎng)方法控制溫度。試驗(yàn)第3～6周冷應(yīng)激組、冷應(yīng)激+NAC組控制在（10±2）℃，而對(duì)照組與NAC組控制在（26±2）℃，濕度控制在50%～60%。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo) 每周對(duì)試驗(yàn)肉雞稱重并記錄每天的采食量。計(jì)算肉雞平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）與飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）。

1.4.2 樣品采集 試驗(yàn)第43天，每組隨機(jī)抽取10只雞（每個(gè)重復(fù)2只）進(jìn)行屠宰，迅速收集十二指腸、空腸、回腸樣品，置于-80℃冰箱凍存待測。

1.4.3 腸道氧化與抗氧化指標(biāo) 將腸道黏膜樣品在液氮下研磨，取研磨樣（約0.1 g）加入預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿、離心，取上清液進(jìn)行分析[11]。通過試劑盒法（南京建成生物技術(shù)研究所）測定腸道組織中丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）的活力。

1.4.4 小腸黏膜形態(tài) 參照Yi等[10]方法，使用4%多聚甲醛固定腸段，經(jīng)包埋、切片，蘇木素-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，測量絨毛的絨毛高度（VH，單個(gè)絨毛從絨毛頂端到腸腺開口處的距離）和隱窩深度（CD，單個(gè)絨毛從隱窩開口處到基底膜的距離）。每個(gè)腸段選取10個(gè)最長、最直的絨毛進(jìn)行觀測。

1.4.5 腸道能量狀態(tài)檢測 參照Yi等[12]方法，采用高效液相色譜法對(duì)腸道黏膜樣品中一磷酸腺苷（AMP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）的含量進(jìn)行測定。將黏膜樣品（0.1～0.2 g）與預(yù)冷的高氯酸勻漿離心。取上清液（1 mL）加入等體積的碳酸鉀并調(diào)節(jié)pH，再離心收集上清液。依據(jù)洗脫峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算腸道腺苷酸（AMP、ADP、ATP）含量，并根據(jù)公式計(jì)算能荷（AEC）與腺苷酸池（TAN）水平，用μg/g腸道重表示：

1.4.6 空腸功能相關(guān)基因mRNA水平的檢測 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測空腸相關(guān)基因的mRNA水平。利用TRIzol（Invitrogen公司）試劑進(jìn)行空腸黏膜樣品的總RNA提取和純化，然后通過NanoDrop?ND-2000紫外可見光光度計(jì)（Thermo Scientific公司）進(jìn)行總RNA的定量，用OD260/OD280衡量RNA的純度，并通過1%變性凝膠電泳檢測RNA的完整性?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄通過Prime Script?RT reagent kit試劑盒法，將cDNA置于-20℃保存待測。通過引物（表2）在PCR儀（ABI7500）進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)（SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒），主要檢測的基因?yàn)镚APDH（內(nèi)參）、細(xì)胞色素氧化酶3（COXIII）、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、熱休克蛋白70（HSP70）、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PepT1）、黃嘌呤氧化還原酶（XOR）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、血紅素加氧酶-1（HMOX-1）、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）、緊密連接蛋白ZO-2（ZO-2）、腺嘌呤核苷載體（ANT）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、ATP合成酶β亞基（ATP5B）、緊密連接蛋白Claudin-5（Claudin-5）、鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1（SGLT-1）等。參照Fu等[13]對(duì)各基因PCR數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行分析，表2為RT-PCR擴(kuò)增的基因及內(nèi)參GAPDH的引物序列[11]。

1188 分子氫對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)高水平小劑量電離輻射損傷的防護(hù)作用 郭佳銘，和生輝，熊澤森，劉 哲，趙海男，劉鵬飛，顏宏利，高 福，李百龍

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0中的一般線性模型（GLM）進(jìn)行兩因子（日糧和溫度）方差分析。試驗(yàn)各組間的差異采用Duncan's法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞生長性能的影響 由表3可知，冷應(yīng)激極顯著降低了肉雞前期（1～21 d）、后期（22～42 d）及全期（1～42 d）的ADFI和ADG（P＜0.01），但極顯著提高了肉雞的FCR（P＜0.01）；而NAC對(duì)肉雞ADFI、ADG、FCR均無顯著影響（P＞0.05）。

表2 檢測基因?qū)?yīng)的上、下游引物序列

2.2 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表4可知，冷應(yīng)激極顯著提高了肉雞空腸CD（P＜0.01）；NAC顯著降低了肉雞空腸、回腸CD（P＜0.05），極顯著提高了回腸VH/CD（P＜0.01）。此外，NAC與冷應(yīng)激對(duì)肉雞十二指腸和空腸的VH、VH /CD及回腸VH的影響存在交互作用（P＜0.05）。冷應(yīng)激刺激下，NAC顯著提高了十二指腸和空腸的VH、VH/CD及回腸的VH（P＜0.05）；常溫下，NAC顯著提高了回腸的VH和空腸VH/CD（P＜0.05）。

表3 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞生長性能的影響

表4 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞能量代謝的影響 由表5可知，冷應(yīng)激顯著提高了回腸AMP含量（P＜0.05）。NAC與冷應(yīng)激對(duì)空腸ATP、TAN、AEC和回腸ATP、ADP與AEC的影響存在交互作用（P＜0.01）。常溫下，NAC顯著降低了肉雞空腸ATP、AEC和回腸ATP含量（P＜0.05）；而冷應(yīng)激刺激下，NAC顯著提高了肉雞空腸ATP、TAN和回腸ATP、ADP與AEC的含量（P＜0.05）。

2.4 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞抗氧化相關(guān)酶的影響 由表6可知，NAC提高了肉雞十二指腸與空腸GSH-Px、回腸SOD（P＜0.01）和空腸CAT活力（P＜0.05）；冷應(yīng)激提高了肉雞十二指腸GSH-Px的活力（P＜0.05）。此外，NAC與冷應(yīng)激對(duì)回腸GSH-Px活力的影響存在相互作用（P＜0.01）。冷應(yīng)激刺激下，NAC顯著提高了肉雞十二指腸SOD和CAT活力、空腸SOD、回腸GSH-Px活力（P＜0.05）；常溫條件下，NAC顯著降低了肉雞空腸SOD活力（P＜0.05）。

2.5 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞空腸功能相關(guān)基因影響 由表7可知，NAC極顯著提高了肉雞空腸中PGC-1α、COXIII和Claudin-5mRNA水平（P＜0.01）；冷應(yīng)激顯著降低了肉雞空腸中HIF-1αmRNA水平（P＜0.05）。此外，NAC與冷應(yīng)激對(duì)空腸HMOX、SGLT-1與PepT1mRNA水平存在交互作用（P＜0.01）。冷應(yīng)激刺激下，NAC提高了肉雞空腸HMOXmRNA水平（P＜0.05）；而常溫條件下，NAC降低了肉雞空腸SGLT-1和PepT1mRNA水平（P＜0.05）。

表5 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞能量代謝的影響

表6 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞抗氧化相關(guān)酶的影響

3 討 論

3.1 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞生長性能的影響 研究表明，低溫可使肉雞的ADFI和ADG下降而FCR提高，生產(chǎn)性能下降[14]，這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。雖然日糧中添加0.1%NAC可降低熱應(yīng)激肉雞的死亡率和FCR[10]，減輕黃曲霉毒素B1對(duì)肉雞的毒害作用[8]，但本試驗(yàn)證實(shí)0.1%NAC對(duì)冷應(yīng)激肉雞的生長性能并無改善作用。因此，NAC對(duì)肉雞的作用效果可能與應(yīng)激模型有關(guān)。

表7 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞空腸功能相關(guān)基因的影響

緊密連接成分存在于上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間，具有調(diào)節(jié)腸道上皮組織細(xì)胞間相互作用的能力，對(duì)維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能十分重要。參與形成緊密連接的蛋白主要有Occludin蛋白、Claudin蛋白及黏附分子（JAM）等。Claudins作為緊密連接的主要功能蛋白，參與維持緊密連接的選擇通透性和細(xì)胞極化，維持腸道屏障功能的完整性，從而使腸道具備防止有毒大分子物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)造成損傷的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.1%NAC增加了肉雞空腸Claudin-5mRNA水平，說明NAC可能通過調(diào)控腸道緊密蛋白的基因表達(dá)改善腸道的屏障功能。

3.3 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞能量狀況的影響 機(jī)體生命活動(dòng)的直接能量來源是ATP，機(jī)體中存在反應(yīng)：2ADP→ATP+AMP，這一反應(yīng)始終保持動(dòng)態(tài)平衡，構(gòu)成了 ATP 循環(huán)。TAN 是 AMP、ADP 與 ATP 之和，其大小體現(xiàn)了線粒體產(chǎn)生高能磷酸化合物的能力及細(xì)胞的能量儲(chǔ)備[11]。AEC反映高能磷酸鍵在AMP、ADP及ATP間的相互轉(zhuǎn)換[9]，當(dāng)細(xì)胞能量儲(chǔ)備不足時(shí)，AEC的含量會(huì)發(fā)生改變。此外，免疫應(yīng)激會(huì)增加機(jī)體代謝速率、體溫與靜息能量消耗，使動(dòng)物對(duì)能量需求增加。NAC可以清除冷應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，從而減少線粒體膜的脂質(zhì)過氧化，并將受損害的線粒體膜及線粒體氧化磷酸化功能進(jìn)行修復(fù)與維護(hù)，進(jìn)而使ATP生成量增加[15]。

本試驗(yàn)表明，冷應(yīng)激增加了肉雞回腸AMP含量，降低了空腸TAN含量，肉雞在冷應(yīng)激刺激下腸道代謝增強(qiáng)，消耗更多能量，而在日糧中添加0.1%NAC提高了冷應(yīng)激肉雞空腸ATP、TAN和回腸ATP、ADP與AEC的含量，表明NAC可緩解冷應(yīng)激造成的能量消耗，保護(hù)線粒體的氧化磷酸化能力從而提高ATP的產(chǎn)生及細(xì)胞的能量儲(chǔ)備，這與高健等[16]的結(jié)果相類似。其可能的原因是NAC可以促進(jìn)GSH的產(chǎn)生，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，從而使機(jī)體獲得高能量；或者NAC的還原性巰基基團(tuán)（-SH）能抑制應(yīng)激介導(dǎo)產(chǎn)生炎性物質(zhì)與自由基，并修復(fù)其結(jié)構(gòu)、保護(hù)線粒體氧化磷酸化功能，從而使ATP生成量增加[17]。

PGC-1α是能量代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄輔助活化因子，且在線粒體合成與調(diào)節(jié)適應(yīng)性產(chǎn)熱過程中發(fā)揮重要作用，在寒冷刺激下其表達(dá)量會(huì)增加[18]。COXIII是線粒體呼吸鏈氧化磷酸過程中的關(guān)鍵酶，其在活性氧自由基（ROS）的生成與ATP的合成過程起作用。若COXIII的表達(dá)量降低，會(huì)促使呼吸鏈產(chǎn)生ROS且使ATP合成受阻[19]。本研究表明，日糧中添加0.1%NAC使肉雞空腸PGC-1α與COXIIImRNA水平增加，說明NAC可能通過促進(jìn)線粒體合成和調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈氧化磷酸過程使ATP的產(chǎn)生量增加，這與Yi等[10]的研究一致。

3.4 NAC和冷應(yīng)激對(duì)肉雞抗氧化能力的影響 正常情況下，腸道存在氧化與抗氧化系統(tǒng)，故腸道內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。然而，應(yīng)激狀態(tài)下自由基清除酶會(huì)被大量消耗，從而使機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[20]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。CAT是主要存在于體內(nèi)組織細(xì)胞的過氧化酶，能將SOD歧化自由基形成的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O與O2，還能與GSH-Px協(xié)同分解清除過氧化氫[21]。本研究表明，冷應(yīng)激處理提高了肉雞十二指腸GSH-Px的活力。Gumuslu等[22]也證明，慢性冷應(yīng)激可使鼠紅細(xì)胞CAT與 GSH-Px活性升高。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.1%NAC能提高冷應(yīng)激肉雞十二指腸SOD與CAT、回腸GSH-Px和空腸SOD的活力，說明NAC能緩解冷應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，提高冷應(yīng)激肉雞的抗氧化能力；另一方面，常溫下NAC對(duì)肉雞十二指腸SOD和CAT、回腸GSH-Px的活力并無顯著影響，再次表明NAC的作用效果可能與肉雞應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)，提示生產(chǎn)實(shí)踐中NAC可用于緩解或預(yù)防肉雞應(yīng)激。

HIF-l是缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞全局性調(diào)控因子，可精確調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中的氧氣濃度，提高機(jī)體對(duì)低氧的適應(yīng)能力。HIF-1由HIF-lα與HIF-lβ2種亞基組成， HIF-l的調(diào)節(jié)亞基和活性亞基均為HIF-lα，其水平受氧分壓的調(diào)控。Stroka等[23]研究報(bào)道，大鼠在低氧應(yīng)激1 h后HIF-1α的活性在肝臟及腎臟最高，而持續(xù)應(yīng)激4 h后，降至基線水平。本研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激降低了肉雞空腸HIF-1αmRNA水平，因此，長時(shí)間的持續(xù)低溫可影響HIF-1α的活性和基因表達(dá)。

血紅素加氧酶（HMOX）有HMOX-1、HMOX-2與HMOX-3 3個(gè)亞型。其中，HMOX-1也稱熱休克蛋白-32（Hsp32），對(duì)細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激作用[24]。各種能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的刺激（如缺血、出血性休克、熱應(yīng)激、低氧和活性氧）均能引起HMOX-1發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加0.1% NAC提高了冷應(yīng)激肉雞空腸HMOXmRNA水平，說明NAC可能通過參與調(diào)控HMOX的基因表達(dá)來提高冷應(yīng)激肉雞的抗氧化能力。

4 結(jié) 論

日糧中添加0.1%的NAC可改善腸道的組織形態(tài)和能量狀況，提高冷應(yīng)激肉雞腸道的抗氧化能力。

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