楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，呂學(xué)斌

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

miRNA是一類內(nèi)生的、長度約為20～22個核苷酸，通過結(jié)合到靶mRNA上參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控、脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝等生理過程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。miR-1可通過HDAC4作為靶基因促進(jìn)肌發(fā)生，對調(diào)節(jié)骨骼肌增殖與分化起了非常重要的作用[4]，它會與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)心肌細(xì)胞膨脹，從而抑制心肌細(xì)胞的增殖；miR-27是迄今發(fā)現(xiàn)與人類脂肪細(xì)胞分化相關(guān)性最強的miRNA之一，其過表達(dá)能夠降低LPL基因的表達(dá)量，進(jìn)而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達(dá)；miR-369通過招募AGO2和FXR1蛋白復(fù)合體結(jié)合到腫瘤壞死抑制因子-α基因3'UTR區(qū)域的腺嘌呤/尿嘧啶富集元件上靶向調(diào)控TNF-α的表達(dá)[5]，TNF-α與豬肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)；miR-378與脂肪分化密切相關(guān)，其在小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化成熟后表達(dá)量明顯上調(diào)[6-7]，miR-378還可通過影響雄烯酮和糞臭素代謝而對公豬的膻味起調(diào)控作用進(jìn)而影響豬肉質(zhì)[8]。我國的地方豬種以肌內(nèi)脂肪含量（IMF）高、肌纖維細(xì)、肉質(zhì)風(fēng)味好著稱，但各個地方豬種間又存在一定差異，如藏豬和雅南豬的IMF、丫杈豬和烏金豬的瘦肉率極顯著高于其他地方豬種，其他肉質(zhì)性能指標(biāo)也存在顯著或極顯著差異。

簽于這4種miRNA與豬肉品質(zhì)調(diào)控存在的關(guān)系，研究采用q-PCR技術(shù)對四川省7個地方豬種背最長肌組織中miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378的表達(dá)與肉質(zhì)性狀的差異進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探明不同豬種肉質(zhì)差異形成的分子機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為培育優(yōu)質(zhì)高效的新品種/配套系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣本采集 藏豬、成華豬、雅南豬、丫杈豬、青峪豬、內(nèi)江豬和烏金豬均由四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地提供。每個豬種隨機選取6頭，共計42頭，所有實驗豬于同一時間開始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營養(yǎng)水平和飼喂方式，達(dá)到9月齡時進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對應(yīng)處的背最長肌組織，用于后續(xù)的肉質(zhì)相關(guān)表型指標(biāo)測定和miRNA熒光定量檢測。

1.2 IMF測定 采用瑞士步琪（BUCHI）全自動快速抽提儀進(jìn)行抽提，程序設(shè)置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個樣本獨立測定2次。樣品處理和實驗操作嚴(yán)格按照國標(biāo)GB/T 9695.1-2008《肉與肉制品游離脂肪含量測定》進(jìn)行。

1.3 肌纖維面積測定 采用KD-2508 型切片機（Kedee，China）制作背最長肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統(tǒng)（Optec，China）采集代表性區(qū)域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測定每個樣品中100根肌纖維的面積。

1.4 硫胺素含量測定 樣本處理和實驗方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.84-2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測定 測量左胴體倒數(shù)3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計算眼肌面積。按《豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范—NY/T825-2004》方法測定并計算瘦肉率。

1.6miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378含量的測定 肌肉組織中總RNA提取：肌肉組織的RNA按照miRNeasy Mini Kit（Qiagen，China）的操作說明書提取，采用NanoDrop ND-1000（Thermo公司）測定260/280 nm 的ratio值（ratio ＞ 2.0）檢測總RNA的質(zhì)量和濃度，檢測合格用于后續(xù)實驗。qRT-PCR：采用miScript II RT Kit（Qiagen，China）根據(jù)操作說明將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用 miScript SYBR? Green PCR Kit（Qiagen，China） 在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進(jìn)行熒光定量檢測，每個反應(yīng)體系20 μL。5 S、18 S和U6作為miRNA定量的內(nèi)參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過熔解曲線分析驗證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無引物二聚體，每個樣本重復(fù)3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2?ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.0對性狀指標(biāo)和基因表達(dá)量進(jìn)行ANOVA分析，相關(guān)性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量 由表2可知，在7個地方豬種中，藏豬IMF最高（5.59%），其次為雅南豬（5.07%），青峪豬最低（3.29%），均屬于高IMF豬種，其中藏豬、雅南豬和內(nèi)江豬的IMF極顯著高于成華豬、丫杈豬、青峪豬和烏金豬（P＜0.01）；藏豬肌纖維直徑最?。?8.72 μm），其他6個豬種的肌纖維直徑為73～80 μm，藏豬的肌纖維直徑顯著小于其他豬種（P＜0.05）；7個豬種的眼肌面積為14～23 cm2，藏豬、成華豬和青峪豬的眼肌面積顯著低于其他豬種（P＜0.05）；青峪豬的瘦肉率最低（42.61%），其次為藏豬（42.65%），烏金豬的瘦肉率最高（49.27%），丫杈豬的瘦肉率達(dá)到了45%以上（47.07%），烏金豬和丫杈豬的瘦肉率顯著低高于藏豬、成華豬、雅南豬、內(nèi)江豬和青峪豬（P＜0.05）；雅南豬的硫胺素含量最高，為2.79 μg/g，其次是藏豬（2.12 μg/g），丫杈豬硫胺素含量最低，為0.60 μg/g，極顯著低于其他6個豬種（P＜0.01），而內(nèi)江豬和青峪豬肌肉中硫胺素含量顯著低于藏豬、成華豬、雅南豬和青峪豬（P＜0.05）。

表1 引物信息表

2.2 4種miRNA的表達(dá)水平 由表3可知，內(nèi)江豬的miR-27a、miR-378的相對表達(dá)量最高，其次為藏豬，最低的為丫杈豬，丫杈豬和烏金豬的miR-27a、miR-378的相對表達(dá)量極顯著低于其他5個豬種（P＜0.01），內(nèi)江豬的miR-27a、miR-378的相對表達(dá)量顯著高于藏豬、成華豬、雅南豬和青峪豬（P＜0.05）；成華豬的miR-369的相對表達(dá)量最高，其次為雅南豬，最低的為丫杈豬， 內(nèi)江豬、丫杈豬和青峪豬的miR-369的相對表達(dá)量極顯著低于其他4個豬種（P＜0.01），藏豬和烏金豬的miR-369的相對表達(dá)量顯著低于成華豬和雅南豬（P＜0.05）；藏豬miR-1的相對表達(dá)量最高，其次為成華豬，最低的為丫杈豬，內(nèi)江豬、丫杈豬和烏金豬的miR-1相對表達(dá)量極顯著低于藏豬、成華豬和雅南豬（P＜0.01），青峪豬和雅南豬的miR-1相對表達(dá)量顯著低于藏豬和成華豬（P＜0.05），青峪豬極顯著高于內(nèi)江豬、丫杈豬和烏金豬（P＜0.01）。

2.3 4種miRNA的表達(dá)水平與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)含量的相關(guān)性 由 表 4可知，miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1在背最長肌中的表達(dá)水平與IMF和硫胺素含量呈 正 相 關(guān)（rIMF=0.4～0.7；r硫 胺 素 =0.09～0.85），其中miR-369與硫胺素呈顯著正相關(guān)（r=0.801，P＜0.05）；miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1在背最長肌中的表達(dá)水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負(fù)相關(guān)（r肌纖維直徑=-0.08～-0.55；r眼肌面積=-0.20～-0.85；r瘦肉率=-0.24～-0.70），其中miR-1與眼肌面積呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.804，P＜0.05）。

3 討 論

3.1 肌纖維直徑、IMF、眼肌面積、瘦肉率和硫胺素對肉質(zhì)的影響 探明豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因或調(diào)控因子差異表達(dá)的分子遺傳機理，從而有效地控制和提高豬肉品質(zhì)，對提供滿足消費者需求的豬肉產(chǎn)品具有重要意義。近年來育種學(xué)家已在豬肉質(zhì)的調(diào)控機理方面做了大量研究[9-11]，然而這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能的深入研究，從轉(zhuǎn)錄后的miRNA水平探索豬肉質(zhì)差異形成的分子機理成為研究的熱點。影響豬肉質(zhì)風(fēng)味的因素很多，其中IMF是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味密切相關(guān)[12]，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在7個地方豬種中，IMF在3.29%～5.60%，肉質(zhì)優(yōu)良；肌纖維直徑越細(xì)，肉質(zhì)就越細(xì)嫩，味美。藏豬的肌纖維最細(xì)，其他豬種均在70～80 μm，肉質(zhì)細(xì)嫩；胴體瘦肉率是評價胴體品質(zhì)的主要指標(biāo)，與眼肌面積呈極顯著正相關(guān)，與IMF呈負(fù)相關(guān)，7個豬種的胴體瘦肉率在42%～50%，屬脂肪型豬種，這是我國地方豬種的一個普遍共性；硫胺素是一種非常重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其熱降解是食品加工過程中風(fēng)味形成的主要途徑之一[13]。本研究顯示，藏豬、烏金豬、雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高，風(fēng)味更好。本研究所測的地方豬種均屬于肉質(zhì)優(yōu)良豬種，其風(fēng)味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬培育的育種素材，利用外種豬進(jìn)行雜交改良。

表2 不同豬種相關(guān)肉質(zhì)指標(biāo)含量

表3 不同豬種的miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1水平

表4 miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1與肉質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3.2miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378含量對肌肉生長和脂肪沉積的影響 miRNA對豬肌肉發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在骨骼肌細(xì)胞分化成熟過程中呈一定的時空特異性表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化。miR-27與脂肪代謝和脂類細(xì)胞分化有著重要的聯(lián)系，在調(diào)節(jié)能量代謝的動態(tài)平衡中起著重要的作用，其可通過減少成熟脂肪細(xì)胞分化和減少過氧化物酶體增殖物激活受體γ、視黃素X受體α的表達(dá)來抑制脂肪細(xì)胞的分化[15]。miR-369靶向調(diào)控TNF-a的表達(dá)，在脂肪沉積過程中扮演著重要角色[5]。miR-378受過氧化物酶體增殖物激活受體γ的調(diào)控，減少過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)，可以抑制脂肪細(xì)胞的分化[16]。本研究結(jié)果顯示，背最長肌組織中miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378的表達(dá)水平在7個豬種中趨于一致，具體表現(xiàn)為在藏豬、內(nèi)江豬、雅南豬和成華豬中相對表達(dá)量較高，在丫杈豬和烏金豬中相對表達(dá)量較低，這與它們的生物學(xué)功能相一致。相關(guān)性分析顯示，4種miRNA在背最長肌中的表達(dá)水平與IMF和硫胺素含量呈正相關(guān)，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，表明miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378對豬肉質(zhì)具有正調(diào)控作用，而對豬胴體性能具有負(fù)調(diào)控作用，其可以影響豬肌肉生長和脂肪沉積，為通過調(diào)控其表達(dá)水平實現(xiàn)豬肉質(zhì)風(fēng)味的改善提供了可能。

鑒于miRNAs對豬肌肉生長和脂肪沉積具有重要的調(diào)控功能，有必要對其具體調(diào)控機制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。本研究結(jié)果可為闡明豬肉品質(zhì)形成的分子機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為畜牧業(yè)中的優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬育種提供新的研究思路。

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