楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，呂學(xué)斌

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

miRNA是一類內(nèi)生的、長度約為20～22個核苷酸，通過結(jié)合到靶mRNA上參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，其在基因表達調(diào)控、脂肪細胞分化、脂質(zhì)代謝等生理過程中均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。miR-1可通過HDAC4作為靶基因促進肌發(fā)生，對調(diào)節(jié)骨骼肌增殖與分化起了非常重要的作用[4]，它會與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進心肌細胞膨脹，從而抑制心肌細胞的增殖；miR-27是迄今發(fā)現(xiàn)與人類脂肪細胞分化相關(guān)性最強的miRNA之一，其過表達能夠降低LPL基因的表達量，進而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達；miR-369通過招募AGO2和FXR1蛋白復(fù)合體結(jié)合到腫瘤壞死抑制因子-α基因3'UTR區(qū)域的腺嘌呤/尿嘧啶富集元件上靶向調(diào)控TNF-α的表達[5]，TNF-α與豬肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)；miR-378與脂肪分化密切相關(guān)，其在小鼠3T3-L1前體脂肪細胞分化成熟后表達量明顯上調(diào)[6-7]，miR-378還可通過影響雄烯酮和糞臭素代謝而對公豬的膻味起調(diào)控作用進而影響豬肉質(zhì)[8]。我國的地方豬種以肌內(nèi)脂肪含量（IMF）高、肌纖維細、肉質(zhì)風(fēng)味好著稱，但各個地方豬種間又存在一定差異，如藏豬和雅南豬的IMF、丫杈豬和烏金豬的瘦肉率極顯著高于其他地方豬種，其他肉質(zhì)性能指標也存在顯著或極顯著差異。

簽于這4種miRNA與豬肉品質(zhì)調(diào)控存在的關(guān)系，研究采用q-PCR技術(shù)對四川省7個地方豬種背最長肌組織中miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378的表達與肉質(zhì)性狀的差異進行研究，為進一步探明不同豬種肉質(zhì)差異形成的分子機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為培育優(yōu)質(zhì)高效的新品種/配套系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣本采集 藏豬、成華豬、雅南豬、丫杈豬、青峪豬、內(nèi)江豬和烏金豬均由四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地提供。每個豬種隨機選取6頭，共計42頭，所有實驗豬于同一時間開始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營養(yǎng)水平和飼喂方式，達到9月齡時進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對應(yīng)處的背最長肌組織，用于后續(xù)的肉質(zhì)相關(guān)表型指標測定和miRNA熒光定量檢測。

1.2 IMF測定 采用瑞士步琪（BUCHI）全自動快速抽提儀進行抽提，程序設(shè)置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個樣本獨立測定2次。樣品處理和實驗操作嚴格按照國標GB/T 9695.1-2008《肉與肉制品游離脂肪含量測定》進行。

1.3 肌纖維面積測定 采用KD-2508 型切片機（Kedee，China）制作背最長肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統(tǒng)（Optec，China）采集代表性區(qū)域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測定每個樣品中100根肌纖維的面積。

1.4 硫胺素含量測定 樣本處理和實驗方法參照國家標準GB/T 5009.84-2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測定 測量左胴體倒數(shù)3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計算眼肌面積。按《豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范—NY/T825-2004》方法測定并計算瘦肉率。

1.6miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378含量的測定 肌肉組織中總RNA提?。杭∪饨M織的RNA按照miRNeasy Mini Kit（Qiagen，China）的操作說明書提取，采用NanoDrop ND-1000（Thermo公司）測定260/280 nm 的ratio值（ratio ＞ 2.0）檢測總RNA的質(zhì)量和濃度，檢測合格用于后續(xù)實驗。qRT-PCR：采用miScript II RT Kit（Qiagen，China）根據(jù)操作說明將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用 miScript SYBR? Green PCR Kit（Qiagen，China） 在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進行熒光定量檢測，每個反應(yīng)體系20 μL。5 S、18 S和U6作為miRNA定量的內(nèi)參基因，引物信息見表1。所有目的miRNA定量結(jié)果均通過熔解曲線分析驗證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無引物二聚體，每個樣本重復(fù)3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2?ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.0對性狀指標和基因表達量進行ANOVA分析，相關(guān)性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)肉質(zhì)指標含量 由表2可知，在7個地方豬種中，藏豬IMF最高（5.59%），其次為雅南豬（5.07%），青峪豬最低（3.29%），均屬于高IMF豬種，其中藏豬、雅南豬和內(nèi)江豬的IMF極顯著高于成華豬、丫杈豬、青峪豬和烏金豬（P＜0.01）；藏豬肌纖維直徑最小（68.72 μm），其他6個豬種的肌纖維直徑為73～80 μm，藏豬的肌纖維直徑顯著小于其他豬種（P＜0.05）；7個豬種的眼肌面積為14～23 cm2，藏豬、成華豬和青峪豬的眼肌面積顯著低于其他豬種（P＜0.05）；青峪豬的瘦肉率最低（42.61%），其次為藏豬（42.65%），烏金豬的瘦肉率最高（49.27%），丫杈豬的瘦肉率達到了45%以上（47.07%），烏金豬和丫杈豬的瘦肉率顯著低高于藏豬、成華豬、雅南豬、內(nèi)江豬和青峪豬（P＜0.05）；雅南豬的硫胺素含量最高，為2.79 μg/g，其次是藏豬（2.12 μg/g），丫杈豬硫胺素含量最低，為0.60 μg/g，極顯著低于其他6個豬種（P＜0.01），而內(nèi)江豬和青峪豬肌肉中硫胺素含量顯著低于藏豬、成華豬、雅南豬和青峪豬（P＜0.05）。

表1 引物信息表

2.2 4種miRNA的表達水平 由表3可知，內(nèi)江豬的miR-27a、miR-378的相對表達量最高，其次為藏豬，最低的為丫杈豬，丫杈豬和烏金豬的miR-27a、miR-378的相對表達量極顯著低于其他5個豬種（P＜0.01），內(nèi)江豬的miR-27a、miR-378的相對表達量顯著高于藏豬、成華豬、雅南豬和青峪豬（P＜0.05）；成華豬的miR-369的相對表達量最高，其次為雅南豬，最低的為丫杈豬， 內(nèi)江豬、丫杈豬和青峪豬的miR-369的相對表達量極顯著低于其他4個豬種（P＜0.01），藏豬和烏金豬的miR-369的相對表達量顯著低于成華豬和雅南豬（P＜0.05）；藏豬miR-1的相對表達量最高，其次為成華豬，最低的為丫杈豬，內(nèi)江豬、丫杈豬和烏金豬的miR-1相對表達量極顯著低于藏豬、成華豬和雅南豬（P＜0.01），青峪豬和雅南豬的miR-1相對表達量顯著低于藏豬和成華豬（P＜0.05），青峪豬極顯著高于內(nèi)江豬、丫杈豬和烏金豬（P＜0.01）。

2.3 4種miRNA的表達水平與肉質(zhì)相關(guān)指標含量的相關(guān)性 由 表 4可知，miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1在背最長肌中的表達水平與IMF和硫胺素含量呈 正 相 關(guān)（rIMF=0.4～0.7；r硫 胺 素 =0.09～0.85），其中miR-369與硫胺素呈顯著正相關(guān)（r=0.801，P＜0.05）；miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1在背最長肌中的表達水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負相關(guān)（r肌纖維直徑=-0.08～-0.55；r眼肌面積=-0.20～-0.85；r瘦肉率=-0.24～-0.70），其中miR-1與眼肌面積呈顯著負相關(guān)（r=0.804，P＜0.05）。

3 討 論

3.1 肌纖維直徑、IMF、眼肌面積、瘦肉率和硫胺素對肉質(zhì)的影響 探明豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因或調(diào)控因子差異表達的分子遺傳機理，從而有效地控制和提高豬肉品質(zhì)，對提供滿足消費者需求的豬肉產(chǎn)品具有重要意義。近年來育種學(xué)家已在豬肉質(zhì)的調(diào)控機理方面做了大量研究[9-11]，然而這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能的深入研究，從轉(zhuǎn)錄后的miRNA水平探索豬肉質(zhì)差異形成的分子機理成為研究的熱點。影響豬肉質(zhì)風(fēng)味的因素很多，其中IMF是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味密切相關(guān)[12]，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在7個地方豬種中，IMF在3.29%～5.60%，肉質(zhì)優(yōu)良；肌纖維直徑越細，肉質(zhì)就越細嫩，味美。藏豬的肌纖維最細，其他豬種均在70～80 μm，肉質(zhì)細嫩；胴體瘦肉率是評價胴體品質(zhì)的主要指標，與眼肌面積呈極顯著正相關(guān)，與IMF呈負相關(guān)，7個豬種的胴體瘦肉率在42%～50%，屬脂肪型豬種，這是我國地方豬種的一個普遍共性；硫胺素是一種非常重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，其熱降解是食品加工過程中風(fēng)味形成的主要途徑之一[13]。本研究顯示，藏豬、烏金豬、雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高，風(fēng)味更好。本研究所測的地方豬種均屬于肉質(zhì)優(yōu)良豬種，其風(fēng)味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬培育的育種素材，利用外種豬進行雜交改良。

表2 不同豬種相關(guān)肉質(zhì)指標含量

表3 不同豬種的miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1水平

表4 miR-27a、miR-378、miR-369、miR-1與肉質(zhì)相關(guān)指標的相關(guān)性分析

3.2miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378含量對肌肉生長和脂肪沉積的影響 miRNA對豬肌肉發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在骨骼肌細胞分化成熟過程中呈一定的時空特異性表達，促進骨骼肌細胞分化。miR-27與脂肪代謝和脂類細胞分化有著重要的聯(lián)系，在調(diào)節(jié)能量代謝的動態(tài)平衡中起著重要的作用，其可通過減少成熟脂肪細胞分化和減少過氧化物酶體增殖物激活受體γ、視黃素X受體α的表達來抑制脂肪細胞的分化[15]。miR-369靶向調(diào)控TNF-a的表達，在脂肪沉積過程中扮演著重要角色[5]。miR-378受過氧化物酶體增殖物激活受體γ的調(diào)控，減少過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達，可以抑制脂肪細胞的分化[16]。本研究結(jié)果顯示，背最長肌組織中miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378的表達水平在7個豬種中趨于一致，具體表現(xiàn)為在藏豬、內(nèi)江豬、雅南豬和成華豬中相對表達量較高，在丫杈豬和烏金豬中相對表達量較低，這與它們的生物學(xué)功能相一致。相關(guān)性分析顯示，4種miRNA在背最長肌中的表達水平與IMF和硫胺素含量呈正相關(guān)，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負相關(guān)，表明miR-1、miR-27a、miR-369和miR-378對豬肉質(zhì)具有正調(diào)控作用，而對豬胴體性能具有負調(diào)控作用，其可以影響豬肌肉生長和脂肪沉積，為通過調(diào)控其表達水平實現(xiàn)豬肉質(zhì)風(fēng)味的改善提供了可能。

鑒于miRNAs對豬肌肉生長和脂肪沉積具有重要的調(diào)控功能，有必要對其具體調(diào)控機制進行系統(tǒng)深入的研究。本研究結(jié)果可為闡明豬肉品質(zhì)形成的分子機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為畜牧業(yè)中的優(yōu)質(zhì)風(fēng)味豬育種提供新的研究思路。

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