尹夢迪，黃永震，王周利，姜艷芬，郭抗抗，王晶鈺，張彥明，賀 花

（1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100；3.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

中國是世界上最大的豬肉生產(chǎn)和消費國，中國豬肉消費量約占全球豬肉消費量的一半。 隨著我國國民對豬肉類需求量的提高，豬的日增重、飼料轉化率及抗病性等顯著提高，然而肉品質卻顯著下降。隨著消費者對豬肉品質的日益注重，僅在飼養(yǎng)中改變豬的進食營養(yǎng)配比已不能從根本上解決問題，只有對種豬進行改良才能從根本上解決肉的品質問題，因此種豬改良迫在眉睫?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)人工選育方法表現(xiàn)出時間跨度長、強度高等缺陷，因而在科學研究上，豬的遺傳改良有很大的發(fā)展空間。

豬肉品質常用嫩度、持水力、風味、香味和營養(yǎng)成分等進行評定。大多數(shù)決定肉質性狀的肌纖維（MF）特性具有遺傳效應，受基因調(diào)控[1]。目前，已確定影響肉品質的主效基因僅為氟烷基因和RN-基因[2]。為了發(fā)現(xiàn)更多的影響肉品質的主效基因，可以應用高通量測序（High-Throughput Sequencing）技術以對一個物種的基因組與轉錄組進行深入全貌的分析，從而幫助科學家找到更多影響豬肉品質的基因。作為基因組研究的重要補充，蛋白質測序（Protein Sequencing）是另一重要研究領域。近年來，旨在闡明生物體全部基因組、轉錄組、蛋白質組的研究工作開始大規(guī)模開展。將高通量的測序技術應用于豬肉品質分析，利用各組學技術尋找、篩選并鑒定與肉品質有關的標記基因與蛋白，整合基因組數(shù)據(jù)和蛋白質組數(shù)據(jù)，可幫助研究人員研究影響豬肉品質的遺傳水平因素，進而擴展應用于畜類育種工作中。本文綜述了高通量轉錄組測序技術在研究豬肉品質相關的肌內(nèi)脂肪（IMF）和MF轉錄組的應用，重點闡述了其研究進展。

1 高通量測序技術及其比較

高通量測序具有同時對幾十萬到幾百萬條DNA或RNA分子進行并行測序的功能。第二代測序技術廣泛應用于尋找候選基因，是目前組學研究中的主要技術。高通量測序分類：在基因組水平上，對沒有參考序列的物種進行從頭測序（Denovo Sequencing），對有參考序列的物種，進行全基因組重測序（Resequencing）；在轉錄組水平上，進行全轉錄組測序（Whole Transcriptome Resequencing），或者進行小分子RNA測序（Small RNA Sequencing）。為了對基因組上的甲基化位點和與特定轉錄因子結合的DNA區(qū)域進行檢測，可以采用轉錄組測序與染色質免疫共沉淀（ChIP）技術同時結合甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術。

Roche公司的454焦磷酸測序技術、ABI公司的SOLiD技術和Illumina公司的Solexa技術是具有代表性的第二代測序技術。454焦磷酸測序讀長最長，當讀長超過400 bp時，454焦磷酸測序的準確性仍在99%以上，因而應用最廣泛，但是有誤差隨同聚物增長而增大的局限，且通量低，費用高，使得該測序平臺的市場化普及被限制，常應用在對未知基因組進行從頭測序、獲得新基因的宏基因組學（Metagenomics）及微生物多樣性等領域[3]；Solexa技術序列讀長相對454測序較短，費用也低，同時精確度高，樣品需求量低，操作簡便快速，缺點是判斷AT富集區(qū)域的能力低，所以應用面相較于其他技術較窄，適合基因組重測序、RNA測序、表觀遺傳學研究[4]；SOLiD技術測序讀數(shù)最短，但擴展性較強，準確率高，由于存在著參考序列和讀長無法匹配的可能，常應用于小RNA和全轉錄組等高敏感檢測，同時由于其雙堿基編碼和校正系統(tǒng)的原理與重測序相似，應用于具有高質量參考基因組序列物種的重測序和SNP檢測等[5]（表1）。

盡管新一代測序平臺已經(jīng)顯著降低了測序費用，然而完整的基因組測序費用仍然很高。除了費用高，研究人員還發(fā)現(xiàn)很難從大量變異中鑒定出真正起作用的位點。因此產(chǎn)生了最初就關注編碼區(qū)變異的外顯子捕獲技術，其利用外顯子捕獲芯片從基因組DNA中抓出外顯子部分后測序，但費用仍不低。轉錄組測序（Transcriptome Sequencing）又稱RNA-seq，繼而成為基因組測序的替代，與基因組測序相比，轉錄組測序的弊端是會遺漏一些低表達基因，優(yōu)點是獲得了更多的如基因表達水平和剪接模式的信息。因此在有高表達基因的組織來源并執(zhí)行適當?shù)馁|量控制篩選前提下，轉錄組測序是一種快速廉價的替代方法[6]。高通量轉錄組測序在研究真核生物的基因表達調(diào)控和遺傳育種等方面具有不可估量的潛力。

轉錄組是指在某一特定發(fā)育時期或者某一生理條件下，細胞內(nèi)所有轉錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA和非編碼RNA。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點。轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉錄出來的所有RNA的總和。從總RNA中富集出單鏈mRNA，再反轉錄成雙鏈cDNA，隨后進行高通量測序，并與基因組DNA序列進行比對。對于基因組序列信息已知的生物，依據(jù)現(xiàn)有的基因注釋結果，分析基因在不同組織中的差異表達情況、選擇性剪切（Alternative Splicing，AS）、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）和基因融合等特征。主要步驟：①建庫。提取樣品總RNA，利用脫氧核糖核酸酶（DNAaseI）除去樣品中滯留的DNA，后用含多聚體的磁珠對mRNA分離純化。純化后的RNA序列被隨機打斷成小片段，反轉錄合成cDNA。②上機測序。一般采用雙向測序以提高準確度[7]。③生物信息學分析。將數(shù)以百萬計的reads與參考基因組進行序列比對，進行基因的表達注釋、新轉錄本預測、SNP[8]以及AS[9]等分析。

在眾多的轉錄組學分析方法中，轉錄組測序技術以新一代高通量測序技術為基礎，是一個高度靈活的平臺，與其他轉錄組學技術比較，具有通量高、速度快、成本低、靈敏度高的優(yōu)勢，可以獲得低豐度的表達基因，不局限于已知的基因組序列信息，不需要克隆的步驟，操作簡單，應用領域廣。近年來，隨著轉錄組學與高通量測序技術的高速發(fā)展，目前已超越傳統(tǒng)的基于雜交技術的芯片法和基于一代 Sanger測序的SAGE、MPSS、全長cDNA文庫、EST文庫等方法，成為轉錄組分析的主要手段。

表1 不同測序平臺的高通量測序技術特點比較[2-5]

2 高通量測序技術在IMF中的研究進展

IMF存在于豬的MF內(nèi)部和肌束之間，在相當大的程度上決定著肉品質。適度的脂肪含量可使肌肉口感細膩、香味濃郁。2%～3%的IMF含量對豬肉的食用特性比較理想。IMF與系水力、風味和嫩度有很強的相關性。隨著肌內(nèi)脂肪含量的增多，結締組織的物理強度逐漸降低，肉的嫩度得到改善[10]。譚林等[11]發(fā)現(xiàn)，在適當?shù)姆秶鷥?nèi)（1%～3%），隨著IMF含量的升高，豬肉的大理石紋評分增加，肉的系水力得到改善（表2）。

表2 豬的IMF含量與大理石紋評分[11]

中外豬種在產(chǎn)肉性狀上差異較大，且存在互補性。美國漢普夏豬、杜洛克豬、巴克夏豬、英國大白豬、比利時皮特蘭豬和丹麥長白豬等具有瘦肉率高且生長較快的優(yōu)勢，但肉質風味較差；我國地方豬種一般生長慢、瘦肉率低，但肉質相對較好。榮昌豬的IMF含量、肉色和大理石紋評分顯著高于杜洛克豬，總氨基酸含量和呈味氨基酸總量顯著高于杜洛克豬，背最長肌的飽和脂肪酸含量顯著低于杜洛克豬，單不飽和脂肪酸含量顯著高于杜洛克豬[12]。肌肉和脂肪細胞均來源于中胚層的共同祖先細胞，其發(fā)育是動態(tài)調(diào)控過程，可互相轉換，但關鍵基因的相互作用機制目前仍然不清楚。

數(shù)字化基因表達譜（Digital Gene Expression Profiling，DGEP）結合了新一代高通量測序技術和高性能計算分析技術，可以用來捕捉一個特定組織的整個轉錄組[13]。細胞數(shù)目的增多是導致IMF組織發(fā)育的決定性因素。肌肉組織中存在肌衛(wèi)星細胞（MSCs）和脂肪來源干細胞（ADSCs）2種干細胞群體，體外的研究表明這2種干細胞群體均可以分化為脂肪細胞[14]。張鳳[15]利用肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）處理ADSCs和MSCs，利用Illumina Solexa測序技術對豬的2種干細胞中的RNA進行有參考基因組的表達譜測序，通過比較2種細胞處理前后的差異表達基因，獲得與脂肪發(fā)育相關的基因WISP2和KLF6，并通過構建超表達載體和合成干涉片段，分別從功能獲得和功能缺失兩方面進一步研究，確定KLF6基因促進細胞的成脂分化，而WISP2基因抑制細胞的成脂分化，該結果為研究KLF6的功能提供了基礎數(shù)據(jù)，也為揭示豬脂質代謝的調(diào)控機制提供了試驗參考。KLF6是KLFs家族的成員，可通過與靶基因啟動子上的GC框或CACCC元件相結合從而調(diào)控下游眾多靶基因的表達，前期許多研究發(fā)現(xiàn)KLF6基因與脂肪肝的產(chǎn)生有密切關系[16]。近些年有研究發(fā)現(xiàn)，KLF6參與到機體前體脂肪細胞的分化且對脂肪細胞成脂分化起正向調(diào)控作用[15,17]。KLF6基因在畜禽類中與牛具有最近的親緣關系，其次為山羊、綿羊、豬，與雞具有最遠的親緣關系[18]。由此可以推斷，KLF6基因不僅在豬中，還有極大可能在大部分畜類脂質代謝的調(diào)控中起作用。

邢凱等[19]利用轉錄組測序研究了長白豬、松遼黑豬的脂肪和肝臟組織，篩選出背膘厚極端表型個體間的多個調(diào)節(jié)脂肪代謝的差異基因，初步找到多個調(diào)控脂肪沉積的重要基因和通路，證明了肝臟在動物體內(nèi)脂肪代謝調(diào)控中的關鍵作用。Li等[20]利用miRNA-seq從7、240日齡的榮昌豬背部皮下脂肪中檢測出miR-143、miR-103、miR-148和Let-7等miRNA，發(fā)現(xiàn)仔豬脂肪組織中miR-378表達量最高，成年豬脂肪組織中miR-143表達量最高，且仔豬脂肪組織中miR-143、miR-378、miR-103、miR-148a、miR-21、miR-10b、miR-30a-5p和miR-199a-3p均高表達于2個發(fā)育階段的背部皮下脂肪組織。

比較中外品種間不同發(fā)育點的差異是尋找關鍵基因的一個重要途徑。研究人員可以利用高通量測序技術繪制中外豬種生長發(fā)育時期肌肉的轉錄組和豬的發(fā)育性圖譜，分析標簽和轉錄本的表達模式，尋找重要候選基因，鑒定與肉品質相關重要基因在中外豬種之間存在的差異。張冬杰等[21]構建了民豬（地方脂肪型）和大白豬（西方瘦肉型）背最長肌組織的數(shù)字化基因表達譜（Digital Gene Expression Profiling，DGEP），研究了11個可能與肉品質相關的顯著差異基因，對比發(fā)現(xiàn)差異基因中FAS、FABP4和Cav-1在脂肪型民豬中的表達水平顯著高于瘦肉型大白豬表達量，推斷FAS基因和FABP4基因為與IMF含量正相關的基因。高通量測序在豬IMF相關基因挖掘中的研究進展見表3。

表3 高通量測序在豬的IMF相關基因挖掘中的研究進展

3 高通量測序技術在MF中的研究進展

MF是肌肉的基本構成單位，占畜類肌肉組織的75%～90%，MF的形態(tài)特征是肌肉特性的主要決定因素。其中，MF總數(shù)、橫截面積和長度是MF的3個重要特征指標。不同品種間MF含量不同，MF含量是影響豬肉品質的重要因素，并可以穩(wěn)定遺傳[24]。骨骼肌中纖維類型與肉品質之間存在密切的關系，而纖維的多樣性是由于肌肉組織中蛋白（如肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白）的不同表達導致，600～800 ku的伴肌動蛋白和超過1 200 ku的肌聯(lián)蛋白都會在骨骼肌中特異性大量表達[25]。Larzul等[26]研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素是影響MF類型的主要非營養(yǎng)因素，不同品種豬的MF組成有差異且具有較高的遺傳性，其中1型纖維和2b型纖維的比例都具有高度的遺傳力（h=0.46，h=0.58），通過遺傳育種可以選擇性地降低MF的收縮性能，選擇性地降低肌肉橫斷面中肌紅纖維的比例，最終通過降低宰后pH下降的速率和程度來改善肉質。Kim等[27]基于主成分分析發(fā)現(xiàn)，豬品種之間有明顯的特性差異，眉山豬的肉品質明顯劣于其他品種，而雜交品種和巴克夏豬肌纖維的性能更優(yōu)，表現(xiàn)出更好的肉品質。不同品種豬的MF與肉品質主成分分析見表4。

由上述可知，MF的類型、粗細、長短直接影響肉的口感。彭興[28]構建了不同發(fā)育時間點的豬骨骼肌小RNA文庫，結合Solexa高通量測序結果，初步認定TSC1和SMAD7基因均為miRNA-21的靶標且為miRNA-21下調(diào)，miRNA-21可能通過靶向結合TSCl以及SMAD7參與調(diào)控mTOR信號通路以及TGF-β信號通路來影響肌肉增殖分化，參與骨骼肌的生長調(diào)控。Hou等[29]采用Solexa測序技術在通城豬背最長肌混合RNA文庫中檢測出275個miRNAs，其中miR-1、miR-378和miR-206表達量最高，且miR-378在胚胎期第33天低表達、第65～90天逐漸增加，出生時達最高水平，隨后相對穩(wěn)定，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-378與骨形成蛋白2（BMP）和絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）的增殖和分化均有關。朱嘉宇[30]構建了豬不同類型肌肉組織的基因表達文庫，采用轉錄組測序技術檢測基因表達譜，對其功能進行聚類，Pathway分析，調(diào)控網(wǎng)絡構建，并進行了新轉錄本預測、基因結構優(yōu)化、可變剪切分析以及SNP分析，發(fā)現(xiàn)SUFU基因的3′UTR區(qū)域存在miR-423-5p的結合位點，干擾SUFU能夠抑制C2C12成肌細胞的增殖和分化；miR-423-5p的表達量隨著C2C12細胞分化逐漸上升，在分化的后期達到頂峰，然后逐漸下降；超表達miR-423-5p能夠抑制C2C12細胞分化，并且抑制肌管形成。該研究結果為肌肉發(fā)育和MF類型的調(diào)控機制提供了更加深入的認識，為進一步研究肉品質相關的基因提供了很好的參考。

表4 不同品種豬的主成分分析[27]

根據(jù)表5中相關研究可知，控制細胞的分化方向的基因及通路一旦找到，即可通過操控該基因來控制分化的方向從而在源頭上改變IMF及MF的特征。脂肪沉積通路從脂肪沉積的方向影響IMF。前期大量研究發(fā)現(xiàn)，控制激素及日糧水平可調(diào)節(jié)畜禽基因表達。后期研究應致力于探索通過控制激素水平及日糧中的營養(yǎng)成分來控制含F(xiàn)AS基因及KLF6基因在內(nèi)的IMF相關基因、TSC1、SMAD7及miR-423-5p在內(nèi)的肌肉發(fā)育相關基因轉錄，控制RNA穩(wěn)定性及翻譯水平，有效地控制脂肪與MF在體內(nèi)的合成及代謝。隨著對IMF與肌肉相關基因及通路的不斷挖掘，當脂肪與肌肉含量達到可控，即可向市場上提供規(guī)范與細化的肉類品種，滿足消費者多樣的需求。

4 研究展望

目前轉錄組測序技術仍然面臨挑戰(zhàn)?；陂L讀長的3代測序技術雖然發(fā)展迅速，可測序錯誤率仍然偏高。目前比較好的做法是將3代測序和2代測序相結合，提高轉錄組測序的準確性。目前單細胞RNA-seq（Single-Cell RNA-seq）技術為小樣本量的轉錄組分析提供了有效的分析手段。特別是對于異質性較強的組織樣本，需要在單細胞水平進行轉錄組分析，單細胞轉錄組測序顯示了其獨特的優(yōu)勢。

表5 高通量測序在豬的MF相關基因挖掘中的研究進展

伴隨高通量測序技術的快速發(fā)展，測序費用急劇下降。雖然高通量測序技術在豬肉品質研究中的應用體系目前尚不完善，且較少找到實踐案例，但近年來隨著該技術的不斷發(fā)展，運用高通量測序技術研究豬肉在發(fā)育過程中不同時期、不同品種間的基因差異，挖掘性狀基因和調(diào)控機制，繼而認識和研究肉品差異的遺傳機理的方法被越來越廣泛地應用。運用高通量基因組測序結合相關的基因技術，不但可以對豬的肉品質量進行分析預測，還能通過遺傳育種等技術從根本上改善肉品質量，保留良好的生長性能，提高肉類加工行業(yè)的經(jīng)濟效益。

在遺傳改良上，研究人員通過收集豬種資源，結合各種高通量測序技術進行多組學比較分析，繼而挖掘肉品質關鍵相關基因。在此基礎上建立豬的基因數(shù)據(jù)庫，將對于未來豬的遺傳育種研究有重要意義，發(fā)展豬的分子輔助育種體系，開展豬的基因工程，進行分子標記開發(fā)。將分子標記應用于豬肉品質相關性狀的指數(shù)選擇，建立高效的技術育種體系，通過建立不同標記組合的試驗豬群，選擇最佳標記組合的基因型個體開展定向選育。在豬基因工程技術方面，制備可控表達的轉基因豬。利用體細胞轉基因克隆，進一步全面解析豬肌肉和脂肪發(fā)育分子機制，精準調(diào)控豬肌肉和脂肪發(fā)育，培育優(yōu)質豬種。

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