李 雯， 魏 東

細(xì)胞外微環(huán)境pH值的改變對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮正常的生理功能是非常重要的[1]。在炎癥、缺血、創(chuàng)傷、退行性疾病以及癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)病理情況下，厭氧糖代謝造成的乳酸堆積和ATP水解等釋放大量的H+使得組織內(nèi)pH值極大地降低而出現(xiàn)組織酸化[2～9]，直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及功能改變[10]。1997年，一種能夠被酸化所激活的陽(yáng)離子通道-酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)被發(fā)現(xiàn)之后[11]，大量的研究發(fā)現(xiàn)ASICs特別是其1a亞型(ASIC1a)廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)且在神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[12]，尤其是在癲癇的發(fā)生及發(fā)展領(lǐng)域，ASIC1a已經(jīng)成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。托吡酯(topiramate，TPM)作為選擇性電壓依賴的鈉離子通道阻斷劑，是否通過(guò)對(duì)ASICs的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗癲癇作用尚無(wú)研究報(bào)道，因此，我們采用全細(xì)胞記錄膜片鉗及Western blot定量分析TPM對(duì)ASICs介導(dǎo)電流的調(diào)控作用及對(duì)其蛋白表達(dá)的影響，來(lái)探討ASICs是否是TPM抗癲癇治療的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：懷孕16～17 d的雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)；(2)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及質(zhì)粒：CHO細(xì)胞及ASIC1a、ASIC2a及ASIC3 3種質(zhì)粒(上海交大醫(yī)學(xué)院徐天樂(lè)老師惠贈(zèng))；(3)主要試劑：F12培養(yǎng)基、L型谷氨酰胺等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑(美國(guó)GIBCO公司)，HilyMax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑(日本Dojindo Laboratiories公司)，BCA試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，ASIC1a抗體(美國(guó)Milipore公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國(guó)Milipore公司)，GAPDGH抗體(美國(guó)CST公司)，Nacl、Kcl等電生理試劑(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 胞系的培養(yǎng)及傳代 CHO細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2孵育箱中內(nèi)，采用F12培養(yǎng)基加入50 U/ml的青霉素、1 mmol/L L型谷氨酰胺、50 μg/ml的鏈霉素和10%的胎牛血清，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3 d半量換液。在無(wú)菌情況下傳代，先吸棄原有培養(yǎng)基，PBS洗3遍，加入0.125%的胰蛋白酶消化2～3 min，然后加入含血清的F12培養(yǎng)基終止消化，將貼壁細(xì)胞吹打脫落，吹散后進(jìn)行離心5 min(1000 r/min)，棄上清后，再加入適量培養(yǎng)基，充分吹打重懸，計(jì)數(shù)后進(jìn)行接種備用。

1.3 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng) 將懷孕16～17 d的雌性SD大鼠進(jìn)行乙醚氣體麻醉，剪開消毒過(guò)的腹壁并暴露子宮，取6～8個(gè)胚胎置于玻璃皿中。無(wú)菌的情況下從子宮中剖取胎鼠后夾取頭部置于預(yù)冷過(guò)的DMEM溶液中，解剖顯微鏡下充分剝離腦膜，剝?nèi)ゴ竽X皮質(zhì)以外的其它結(jié)構(gòu)。將其剪碎后，加入0.05%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2孵育箱中消化約5 min，加入10%的胎牛血清高糖DMEM溶液終止消化，充分吹打后過(guò)濾、1000 r/min，5 min離心，棄上清后加入適量接種培養(yǎng)基充分吹打重懸，計(jì)數(shù)后進(jìn)行接種備用。次日更換半量維持培養(yǎng)基(含2%的B27及1 mmol/L L型谷氨酰胺的Neural basal培養(yǎng)液)，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況約2～3 d半量更換培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)的CHO細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)HilyMax liposome transfection reagent所提供的操作方法進(jìn)行。在無(wú)菌情況下操作，每個(gè)60 mm培養(yǎng)皿加入約7～9 μg質(zhì)粒；每個(gè)35 mm培養(yǎng)皿加入約3～4 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染4 h后吸棄含脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，PBS洗一次后更換為維持培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后的24～48 h內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)提取以及電生理實(shí)驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行兩種不同的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，采用相同的質(zhì)粒量進(jìn)行配比混合。

1.5 電生理記錄 本實(shí)驗(yàn)電生理采用電壓鉗條件下的全細(xì)胞記錄模式。配置電極內(nèi)液及細(xì)胞外液的，玻璃微電極采用兩步垂直拉制方法，使其入水電阻約為3.5～5.5 M。灌流給藥采用“Y”管系統(tǒng)依靠重力實(shí)現(xiàn)[13]。實(shí)驗(yàn)時(shí)首先給予玻璃電極內(nèi)施加正壓，通過(guò)步進(jìn)式微操儀將玻璃電極尖端輕壓在細(xì)胞表面，撤除正壓，使細(xì)胞膜吸附于電極尖端，給予串聯(lián)電阻的自動(dòng)補(bǔ)償，逐漸給予負(fù)壓吸引，施加-60 mV鉗制電壓，待形成超過(guò)G級(jí)別的巨阻抗后用負(fù)壓將細(xì)胞膜吸破，使細(xì)胞內(nèi)液與電極內(nèi)液互通而形成全細(xì)胞記錄。所記錄信號(hào)通過(guò)放大器采集后通過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)，使用pCLAMP 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、設(shè)置調(diào)整，使用Clampex 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 免疫印跡

1.6.1 樣本制備 將神經(jīng)元接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6～7 d后給于TPM藥物處理24 h，加入RIPA裂解液，冰上刮取細(xì)胞后進(jìn)行冰上裂解15 min，收集裂解液置入EP管中，進(jìn)行4 ℃低溫離心(13000 r/min)20 min，收集上清，加入SDS上樣緩沖液，金屬浴(95 ℃)煮沸5 min，置于-80 ℃保存。

1.6.2 電泳、轉(zhuǎn)模及免疫顯色檢測(cè) 首先制備SDS PAGE膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白樣品從分離膠中轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜在20%脫脂奶粉PBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入抗體稀釋液配制的一抗(1∶1000)，4 ℃條件下旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜，加入稀釋配制的二抗(1∶2000)，室溫下孵育2 h，最后在暗室中進(jìn)行ECL顯色，使用X光膠片顯影，膠片掃描后使用Image Pro Plus 6.1軟件進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié) 果

2.1 TPM對(duì)不同ASIC亞單位的調(diào)控作用 根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)ASICs的表達(dá)模式，在CHO細(xì)胞系上分別轉(zhuǎn)染了ASIC1a、ASIC2a、ASIC1a+ASIC2a和ASIC3質(zhì)粒，得到ASIC1a同聚體、ASIC2a同聚體、ASIC1a/ASIC2a異聚體和ASIC3同聚體通道。分別對(duì)這4種組合進(jìn)行電生理記錄并給予TPM(300 μM)(見(jiàn)圖1)，發(fā)現(xiàn)不同亞單位組成的離子通道其所通透的內(nèi)向電流曲線對(duì)TPM的反應(yīng)不同，TPM僅對(duì)ASIC1a亞單位組成的同聚體通道有增強(qiáng)調(diào)控作用，而對(duì)另外3種通道均無(wú)明顯的改變。

2.2 TPM對(duì)ASIC1a同聚體通道調(diào)節(jié)作用 TPM對(duì)ASIC1a同聚體通道介導(dǎo)的峰電流的增強(qiáng)效應(yīng)也具有劑量依賴的特性，劑量越大，效應(yīng)越大，最大可有近60%的增強(qiáng)效應(yīng)，其半數(shù)有效劑量約為60 μM(見(jiàn)圖2A)。這種增強(qiáng)效應(yīng)與胞外酸化程度相關(guān)，100 μM的TPM可以增強(qiáng)18%左右pH 6.8誘導(dǎo)的峰電流強(qiáng)度，而在pH 6.0時(shí)則約為40%(見(jiàn)圖2B)。隨后我們采取了4種不同的TPM給藥方式：僅與酸共給、僅預(yù)給10 s、僅預(yù)給10 min、先預(yù)給10 s然后與酸共給，發(fā)現(xiàn)必須在與酸共給的情況下才具有增強(qiáng)效應(yīng)，而兩種僅預(yù)給的方式都不能產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)，這就提示TPM的作用具有通道狀態(tài)依賴的特性，只有通道被打開后才能發(fā)揮作用(見(jiàn)圖2C、D)。

2.3 TPM對(duì)ASIC1a蛋白的表達(dá)作用 我們給于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元不同濃度的TPM作用24 h后提取蛋白樣品，通過(guò)Western blot定量分析，發(fā)現(xiàn)TPM并不影響ASIC1a的蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖3A、B)。

圖1 托吡酯對(duì)不同ASICs通道內(nèi)向電流的調(diào)控作用

(注：n>6，與給藥前相比*P<0.05，NS表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)

圖2 托吡酯對(duì)ASIC1a同聚體通道內(nèi)向電流的調(diào)控作用

(注：n>6， 與給藥前相比*P<0.05 ，NS表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)

圖3 托吡酯對(duì)ASIC1a的蛋白表達(dá)的影響

(注：n=4，NS表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)

3 討 論

酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)最廣泛的ASICs家族成員之一，因其分布廣泛、激活閾值較低并能通透鈣離子而受到研究者的重視，當(dāng)大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元中ASIC1基因被敲除后，原來(lái)酸所激活的電流幾乎被全部去除[14～16]，提示ASIC1a是中樞系統(tǒng)神經(jīng)元中ASICs家族主要的功能性亞單位。大量的研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a參與了體內(nèi)眾多的生理及病理過(guò)程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)目前常用的各類藥物中非甾體抗炎藥[17]、麻醉劑利多卡因[18]以及治療多發(fā)性硬化的藥物4-氨基吡啶[19]對(duì)ASIC1a的功能具有調(diào)節(jié)作用，ASIC1a很可能作為這些藥物的靶點(diǎn)參與了疾病的治療過(guò)程之中。那么，托吡酯(topiramate，TPM)作為一種選擇性阻斷電壓依賴的鈉離子通道藥物，在抗癲癇治療的過(guò)程中是否也通過(guò)ASIC1a發(fā)揮作用的目前尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全細(xì)胞記錄模式及Western blot定量分析探討了TPM對(duì)ASIC1a電流和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，目的在于確定ASICs是否是TPM治療癲癇的可能作用靶點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a非特異性抑制劑阿米洛利能夠延長(zhǎng)由鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇模型發(fā)作的潛伏期時(shí)間，提示ASIC1a可能是癲癇治療的重要靶點(diǎn)，但ASIC1a參與癲癇發(fā)作終止的機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道癲癇發(fā)作后腦組織中出現(xiàn)明顯的酸中毒，導(dǎo)致組織內(nèi)環(huán)境pH值下降，繼而激活了抑制性中樞神經(jīng)元上ASIC1a通道，使癲癇發(fā)作終止[20]。也有研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠的癲癇模型中干擾ASIC1a表達(dá)后，增加了小鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，而在ASIC1a過(guò)表達(dá)小鼠中出現(xiàn)了相反的結(jié)果，這提示可能是由于內(nèi)環(huán)境的酸化激活A(yù)SIC1a而興奮了抑制性中間神經(jīng)元，從而終止了癲癇發(fā)作[21]。

本研究結(jié)果顯示，TPM對(duì)ASIC1a同聚體通道產(chǎn)生的電流具有增強(qiáng)效應(yīng)，而對(duì)ASICs家族其它3種亞型均無(wú)明顯的影響，這種增強(qiáng)效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴的特性，隨著藥物濃度的增大，增強(qiáng)的強(qiáng)度也逐漸增大，同時(shí)與酸化的程度也呈正相關(guān)。那么TPM就有可能通過(guò)增強(qiáng)ASIC1a的電流而使抑制性的中間神經(jīng)元興奮，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)癲癇發(fā)作的抑制。因此ASIC1a很可能是TPM抗癲癇作用的靶點(diǎn)之一。

癲癇發(fā)作和癲癇發(fā)生是兩種不同的病理生理過(guò)程，我們的研究發(fā)現(xiàn)TPM對(duì)ASIC1a同聚體通道產(chǎn)生的電流具有增強(qiáng)效應(yīng)而推論ASIC1a可能是TPM抑制癲癇發(fā)作的靶點(diǎn)之一，但在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)的ASIC1a在癲癇發(fā)生的病理過(guò)程之中扮演什么樣的角色，仍然是未知的領(lǐng)域，需要進(jìn)一步的研究去探索和明確。

綜上所述：我們發(fā)現(xiàn)TPM僅能增強(qiáng)ASICs家族中ASIC1a組成的同聚體通道所產(chǎn)生的內(nèi)向電流，而對(duì)另外3種通道均無(wú)明顯的調(diào)控作用；這種增強(qiáng)效應(yīng)具有劑量依賴的特性，劑量越大，效應(yīng)越大；并且必須在與酸共給的情況下才能發(fā)揮增強(qiáng)效應(yīng)；TPM并不影響ASIC1a的蛋白表達(dá)。這提示ASIC1a可能是TPM抑制癲癇發(fā)作的作用靶點(diǎn)之一。

[1]Chesler M.The regulation and modulation of pH in the nervous system[J].Prog Neurobiol,1990,34(5):401-427.

[2]Chesler M.Regulation and modulation of pH in the brain[J].Physiol Rev,2003,83(4):1183-1221.

[3]Kraut JA,Madias NE.Metabolic acidosis:pathophysiology,diagnosis and management[J].Nat Rev Nephrol,2010,6(5):274-285.

[4]Sutherland SP,Cook SP,McCleskey EW.Chemical mediators of pain due to tissue damage and ischemia[J].Prog Brain Res,2000,129:21-38.

[5]Somjen GG.Acidification of interstitial fluid in hippocampal formation caused by seizures and by spreading depression[J].Brain Res,1984,311(1):186-188.

[6]Wang RI,Sonnenschein RR.PH of cerebral cortex during induced convulsions[J].J Neurophysiol,1955,18(2):130-137.

[7]Messier C,Gagnon M.Glucose regulation and cognitive functions:relation to Alzheimer’s disease and diabetes[J].Behav Brain Res,1996,75(1/2):1-11.

[8]Bowen BC,Block RE,Sanchez-Ramos J,et al.Proton MR spectroscopy of the brain in 14 patients with Parkinson disease[J].AJNR Am J Neuroradiol,1995,16(1):61-68.

[9]Koga K,Mori A,Ohashi S,et al.H MRS identifies lactate rise in the striatum of MPTP-treated C57BL/6 mice[J].Eur J Neurosci,2006,23(4):1077-1081.

[10]Chesler M,Kaila K.Modulation of pH by neuronal activity[J].Trends Neurosci,1992,15(10):396-402.

[11]Waldmann R,Champigny G,Bassilana F,et al.A proton-gated cation channel involved in acid-sensing[J].Nature,1997,386(6621):173-177.

[12]Wemmie JA,Price MP,Welsh MJ.Acid-sensing ion channels:advances,questions and therapeutic opportunities[J].Trends Neurosci,2006,29(10):578-586.

[13]Li WG,Liu MG,Deng SN,et al.ASIC1a regulates insular long-term depression and is required for the extinction of conditioned taste aversion[J].Nat Commun,2016,7(7):13770.

[14]Wemmie JA,Chen J,Askwith CC,et al.The acid-activated ion channel ASIC contributes to synaptic plasticity,learning,and memory[J].Neuron,2002,34(3):463-477.

[15]Xiong ZG,Zhu XM,Chu XP,et al.Neuroprotection in ischemia:blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels[J].Cell,2004,118(6):687-698.

[16]Askwith CC,Wemmie JA,Price MP,et al.Acid-sensing ion channel 2 (ASIC2) modulates ASIC1 H+-activated currents in hippocampal neurons[J].J Biol Chem,2004,279(18):18296-18305.

[17]Voilley N,de Weille J,Mamet J,et al.Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ion channels in nociceptors[J].J Neurosci,2001,21(20):8026-8033.

[18]Lin J,Chu X,Maysami S,et al.Inhibition of acid sensing ion channel currents by lidocaine in cultured mouse cortical neurons[J].Anesth Analg,2011,112(4):977-981.

[19]Boiko N,Kucher V,Eaton BA,et al.Inhibition of neuronal degenerin/epithelial Na+channels by the multiple sclerosis drug 4-aminopyridine[J].J Biol Chem,2013,288(13):9418-9427.

[20]Ziemann AE,Schnizler MK,Albert GW,et al.Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a[J].Nat Neurosci,2008,11(7):816-822.

[21]Guo W,Chen X,He JJ,et al.Down-regulated expression of acid-sensing ion channel 1a in cortical lesions of patients with focal cortical dysplasia[J].J Mol Neurosci,2014,53(2):176-182.