盧 琳， 吳錫階， 彭 華， 陳良萬

主動脈夾層(aortic dissection, AD)是一種十分兇險的疾病，進展快，病死率高[1]，治療以外科手術(shù)為主。一方面，雖然近幾年外科手術(shù)技術(shù)得到不斷創(chuàng)新和改進，但AD的總體死亡率仍較高；另一方面，AD的發(fā)現(xiàn)率不斷上升，在發(fā)達國家，AD每年新增病例約10.4例/百萬人[2]。中國雖沒有大規(guī)模流行病學(xué)統(tǒng)計資料，但近年來隨著診斷技術(shù)的不斷進步，AD的發(fā)現(xiàn)率也越來越高，而且引起AD發(fā)病的危險因素，如高血壓病和動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病率也逐年增加，加上我國人口基數(shù)大，AD的新增病例數(shù)不可忽視。因此，了解AD的發(fā)病機制并進行預(yù)防就顯得尤為重要。

簡單地理解，AD就是血液通過血管壁內(nèi)膜出現(xiàn)的破口進入血管壁中層，使得中層裂開。而血管壁中層的主要成分就是血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。既往研究表明，VSMC體外培養(yǎng)傳代后，其生物學(xué)特性仍然接近體內(nèi)細胞[3]。因此，對人AD的VSMC進行體外培養(yǎng)，同時模擬體內(nèi)干預(yù)條件，觀察細胞的分子生物學(xué)特性變化，是研究AD血管壁生物學(xué)行為和AD發(fā)生發(fā)展過程的重要手段。本研究以組織塊貼壁法培養(yǎng)原代細胞為基礎(chǔ)，總結(jié)一種簡單、方便、可靠的人AD VSMC原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1材料 VSMC培養(yǎng)基及細胞凍存液(美國Sciencell公司)；胎牛血清(法國Scitecher公司)；0.25%胰蛋白酶(美國Gibico公司)；Hank’s液(美國Genview公司)；一抗：α-SMA單克隆抗體、Ⅷ因子抗體，二抗：Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG免疫熒光二抗(英國Abcam公司)；考馬斯亮藍R250染液(美國Sigma公司)。

1.2AD的VSMC的體外培養(yǎng)

1.2.1AD血管的獲取 本研究方案通過醫(yī)院倫理委員會審查，實驗研究符合《赫爾辛基宣言》中提出的倫理原則。所有受試者均簽署書面知情同意書。將患者行手術(shù)治療時清除的病變血管放入含VSMC培養(yǎng)基的無菌容器內(nèi)，四周置冰，迅速送入實驗室。從血管取下到開始培養(yǎng)的時間以不超過2 h為佳。

1.2.2VSMC的原代培養(yǎng) 在超凈工作臺中取出無菌容器放于冰面上，用Hank’s液將夾層血管表面的血液反復(fù)沖洗干凈，用濕棉簽輕輕擦拭血管內(nèi)膜，盡量將內(nèi)膜清除干凈，再用鑷子和眼科剪清除血管外膜。將處理好的血管放入無菌培養(yǎng)皿，加入少量培養(yǎng)基，使血管保持濕潤狀態(tài)。將血管中層剪成1 mm左右的組織塊，再用吸管將組織塊移入25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，組織塊間隔3～5 mm，待培養(yǎng)瓶底部均勻貼滿組織塊后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶底朝上。向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入6 mL平滑肌細胞培養(yǎng)基[每500 mL的培養(yǎng)基配有10 mL的胎牛血清、5 mL平滑肌細胞生長因子(100×)和5 mL 的青霉素/鏈霉素溶液(100×)]，擰緊瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，待組織塊貼附于瓶底后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使得組織塊被培養(yǎng)液充分覆蓋。在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育。7 d后取出培養(yǎng)瓶，更換培養(yǎng)基，觀察VSMC的生長情況。此后隔天更換細胞培養(yǎng)基，直至細胞長至融合成片，進行傳代。

1.2.3VSMC的傳代培養(yǎng) 在融合成片的原代VSMC換液后的第2天，吸除原培養(yǎng)液，用無菌的PBS液輕輕沖洗細胞2遍，再用1 mL 0.25%的胰蛋白酶在37 ℃下消化2 min，待細胞變圓浮起后，加入6倍體積新鮮的VSMC培養(yǎng)液終止消化，并用無菌巴氏吸管吸取細胞培養(yǎng)基輕輕吹打瓶底，使細胞完全脫離瓶底，同時打散細胞，使其均勻懸浮。用細胞計數(shù)板在倒置顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1.0×105mL-1，吸取5 mL傳入新的培養(yǎng)瓶中，過夜，待細胞貼壁后更換細胞培養(yǎng)基，此后隔天更換細胞培養(yǎng)基，每次換液量為4 mL。待細胞長至融合后可再傳代。

1.2.4VSMC的凍存 當(dāng)細胞長至90%以上融合時，可將細胞凍存。按傳代方法將細胞消化完后，將細胞懸液移入無菌離心管，1 500 r/min下離心5 min，棄去上清，加入1 mL細胞凍存液，輕輕混勻成細胞懸液，移入2 mL無菌凍存管中。將細胞凍存管先放入4 ℃冰箱10～20 min，然后放入室溫的細胞凍存盒內(nèi)，密閉凍存盒的蓋子后，放入-80 ℃冰箱過夜，第2天將細胞凍存管轉(zhuǎn)移入液氮罐長期保存。

1.3VSMC的觀察與鑒定

1.3.1細胞生長情況的觀察 將貼壁生長的VSMC直接置于倒置顯微鏡下觀察，記錄細胞的生長狀況及形態(tài)，并拍照記錄。

1.3.2細胞考馬斯亮藍染色 將培養(yǎng)瓶中的VSMC接種到放有無菌玻片的6孔培養(yǎng)板中進行爬片培養(yǎng)，3 d后吸掉培養(yǎng)基，DPBS沖洗2次，經(jīng)2%的多聚甲醛預(yù)固定，1% Trion X-100 4 ℃處理30 min，4%多聚甲醛室溫固定后，用0.2%考馬斯亮藍R250染色，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3細胞α-SMA和Ⅷ因子免疫熒光染色 對細胞爬片進行4%多聚甲醛固定，用正常非免疫血清封閉后，依次加入一抗體(a-SMA 1∶500稀釋、Ⅷ因子1∶100稀釋)、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶200稀釋)和新鮮配制的甘油封閉液(甘油與PBS的體積比為9∶1)封片，避光保存。封片后再置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4透射電鏡觀察 細胞消化離心后，棄上清，對細胞進行固定、脫水、包埋、固化、切片、染色，最后在透射電鏡(JEM-1200EX，日本電子公司)下觀察。

2 結(jié) 果

2.1原代VSMC的培養(yǎng)情況 貼壁培養(yǎng)第7天，倒置顯微鏡下可見少量細胞從組織塊的邊緣遷移出來，新長出的細胞與組織塊呈垂直方向生長，長梭形，有多個細胞突起。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，組織塊周圍細胞密度逐漸增大，并向四周生長，直至與相鄰組織塊長出的細胞融合。從細胞開始萌出到生長至融合，一般需要3～4周。細胞呈現(xiàn)典型的“峰谷狀”生長，即一些地方細胞呈多層生長，細胞之間相互接觸重疊，另一些地方細胞卻生長稀疏，呈單層排列，有些地方甚至無細胞生長。細胞呈長梭形，有多個突起，胞質(zhì)豐富，均質(zhì)透明，細胞核呈卵圓形或圓形居中(圖1)。

2.2原代VSMC的傳代情況 VSMC可連續(xù)傳代，3～5 d可達90%以上融合而進行再次傳代。6代以內(nèi)的VSMC在傳代周期和生長特征上無明顯變化，細胞呈束狀排列，呈現(xiàn)“峰谷狀”生長。6代以后的細胞生長速度明顯減慢，甚至無法融合，而且細胞體積變大，其內(nèi)空泡明顯增多，出現(xiàn)老化現(xiàn)象(圖1D)。

2.3VSMC考馬斯亮藍染色 VSMC經(jīng)考馬斯亮藍染色后，光鏡下可見細胞呈長梭形，有多個突起，胞質(zhì)內(nèi)可見沿細胞長軸排列的微絲，核呈橢圓形或圓形，有些細胞核內(nèi)可見多個核仁(圖2)。

2.4VSMC α-SMA和Ⅷ因子免疫熒光染色 經(jīng)α-SMA免疫熒光染色后的VSMC呈長梭形，多突起，胞質(zhì)內(nèi)可見被染成綠色的細肌絲沿細胞長軸密集排列，幾乎布滿整個細胞，胞質(zhì)不染色；VSMC Ⅷ因子免疫熒光染色陰性(圖3)。

2.5VSMC電鏡鑒定 在電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)有吞飲小泡和大量沿細胞縱軸排列的肌絲，呈現(xiàn)典型收縮表型特征，證實所培養(yǎng)的細胞為VSMC(圖4)。

VSMC:血管平滑肌細胞. A：貼壁培養(yǎng)細胞開始從組織塊邊緣遷移出來( ×40)；B：貼壁培養(yǎng)細胞在組織塊周圍開始增殖，細胞數(shù)量變多( ×40)；C：貼壁培養(yǎng)細胞生長至基本融合，呈現(xiàn)典型“峰谷狀”( ×100)；D：第7代細胞體積變大，胞內(nèi)空泡增多，出現(xiàn)老化現(xiàn)象( ×100).圖1 原代VSMC的貼壁培養(yǎng)和傳代Fig 1 Adhenrent culture of primary human AD VSMC

VSMC:血管平滑肌細胞.圖2 VSMC考馬斯亮藍染色( ×400)Fig 2 Coomassie brilliant blue staining of VSMC( ×400)

3 討 論

機械牽張已經(jīng)被證明是哺乳類動物細胞、組織和器官結(jié)構(gòu)與功能的重要調(diào)節(jié)因子，能誘導(dǎo)細胞增殖、肥大和凋亡，而細胞的這些過程直接影響了動脈粥樣硬化、高血壓病和血管再狹窄等疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。VSMC是主動脈中層最重要的組成部分，主要功能是感受機械牽張[5]。血壓的升高能使血管壁機械張力增加。在歐美國家，高血壓病和動脈粥樣硬化是AD最常見的病因[6-9]。我國目前還沒有相關(guān)的流行病學(xué)資料，但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，大部分AD患者(70%～90%)都合并高血壓病。隨著我國人口的老齡化以及高血壓病發(fā)病率的逐年升高，高血壓病已成為我國AD發(fā)病的最主要原因[10-11]。因此，人AD的VSMC的體外培養(yǎng)和傳代并對其進行牽張，對研究AD的細胞生物學(xué)變化，從而進一步研究AD的發(fā)病機制有重要的意義。

VSMC:血管平滑肌細胞. A～C：α-SMA免疫熒光染色； A1～C1：Ⅷ因子免疫熒光染色； A，A1：細胞質(zhì)染色； B，B1：細胞核染色； C，C1：細胞質(zhì)和細胞核同時染色.圖3 VSMC α-SMA及Ⅷ因子免疫熒光染色Fig 3 VSMC α-SMA and Ⅷ factor immunofluorescent staining

VSMC:血管平滑肌細胞. 圖4 VSMC在透射電鏡下的表現(xiàn)Fig 4 The appearance of VSMC under transmission electron microscopy

受限于取材，目前很多實驗室仍采用豬、兔、鼠等動物的血管進行VSMC的培養(yǎng)和傳代，但動物和人屬于不同物種，在生物學(xué)上存在很大差異。也有采用人臍動脈或者股動脈血管進行VSMC培養(yǎng)[12-13]，但這些血管均屬于外周血管，不能代表主動脈血管所具有的特點，而且取材困難。本實驗基于筆者科室在臨床中收集大量手術(shù)治療的AD病例，以術(shù)中切除的AD血管為原料，采用組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)出原代人AD的VSMC，并進行傳代培養(yǎng)。

VSMC原代培養(yǎng)的方法有很多，目前主要使用的有酶消化法和組織塊貼壁法兩種。實驗初期，筆者試圖采用Ⅰ型膠原蛋白酶或者含EDTA的0.25%胰酶消化AD血管[14]，但效果不佳，消化時長很難控制。消化時間短時細胞量太少；消化時間長時，細胞受損厲害，接種后成功率不高。究其原因，可能是人主動脈血管壁的厚度明顯大于動物，并且其中層組織非常緊實，不易被消化；也可能是操作過程中的某個步驟出現(xiàn)疏忽，影響了結(jié)果。此外，人VSMC的培養(yǎng)難度也大于動物。因此，筆者改用組織塊貼壁法培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡單，技術(shù)難度不大，細胞生長率高，一旦傳代可獲得大量的細胞，可為后續(xù)研究提供充足的細胞。

雖然VSMC的表型多樣，具有顯著的不均一性，但均表達α-SMA[15-16]。筆者培養(yǎng)的細胞通過免疫熒光檢測可見α-SMA的強表達，而Ⅷ因子免疫熒光染色陰性，考馬斯亮藍染色和電鏡下均可見細胞內(nèi)大量沿縱軸排列的肌絲，說明所培養(yǎng)的細胞為收縮表型的VSMC，而非成纖維細胞或內(nèi)皮細胞。

筆者在細胞培養(yǎng)過程中有幾點體會：(1)不論是取材還是細胞培養(yǎng)，所有操作都應(yīng)嚴格遵循無菌原則。(2)AD血管從人體取下后，應(yīng)盡早送入實驗室接種，2 h內(nèi)最佳，不宜超過4 h,但如果放入細胞培養(yǎng)液中，則可以在4 ℃下過夜保存。(3)修剪組織塊時盡量去除內(nèi)膜和外膜，以提高純度。由于AD血管壁中層組織很厚，經(jīng)常夾帶部分中層組織，修剪時注意減少牽拉，以減少對細胞的損傷。(4)組織塊大小以1 mm為宜。太大會影響組織塊內(nèi)部細胞向外遷移，太小對組織塊的損傷大，細胞不易遷移出來。(5)組織塊貼壁間距以3～5 mm為宜，太稀疏時細胞融合時間過長，太密時培養(yǎng)液的營養(yǎng)消耗大，無法支持7 d。(6)貼壁時，將組織塊蘸取細胞培養(yǎng)基后貼在培養(yǎng)瓶底部，貼壁時間以組織塊貼住瓶底而周圍的培養(yǎng)基未干涸為準，一般為3 h。如果貼壁超過6 h，組織塊周圍的培養(yǎng)基干涸，會影響細胞遷移的成功率。(7)開始培養(yǎng)的7 d之內(nèi)，盡量不要移動培養(yǎng)瓶，不要觀察，也不要更換培養(yǎng)基，以免影響細胞遷移。(8)關(guān)于細胞感染：只要在取材和操作時注意無菌原則，一般不會出現(xiàn)感染。(9)在相同培養(yǎng)條件下，年齡小的患者較年齡大的患者組織塊更具增殖能力，細胞向外遷移快，長滿融合的時間短，傳代時間也短。(10)細胞傳代時，胰酶消化的時間不能固定，應(yīng)該適時在倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓浮起后及時終止消化。

筆者應(yīng)用組織塊貼壁培養(yǎng)的方法，成功地在體外培養(yǎng)了人AD的VSMC，為今后研究AD的發(fā)病機制提供良好的實驗基礎(chǔ)。該方法方便，簡單，技術(shù)要求不高，易于推廣，在人AD疾病的研究中具有重要的研究價值。