董至恒，石瑞文，包小妹，王玉華，張燁，關(guān)海濱，*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）屬于德氏乳桿菌屬保加利亞亞種，革蘭染色陽性、兼性厭氧、不移動(dòng)、不產(chǎn)芽孢的乳酸菌（lactic acid bacterium，LAB）[1]，因其能賦予酸奶獨(dú)特的口味，目前被廣泛應(yīng)用于酸奶的發(fā)酵。此外，保加利亞乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫力、抵御病原微生物的侵襲等生理作用，因此被廣泛應(yīng)用于保健品及藥品的主要成分[2]。保加利亞乳桿菌可通過液體發(fā)酵的方法大量獲得，并通過冷凍干燥的方法制得菌粉，菌粉是菌種的最佳保存方式，因此可用作酸奶的直投式發(fā)酵劑、藥品以及保健品領(lǐng)域。

在工業(yè)生產(chǎn)過程中，凍干過程會對保加利亞乳桿菌造成嚴(yán)重?fù)p傷，主要表現(xiàn)在冰晶的形成對細(xì)胞膜產(chǎn)生的機(jī)械性損傷，蛋白質(zhì)的變性失活，細(xì)胞膜通透性的改變，DNA損傷等因素[3-4]。然而菌體為了適應(yīng)低溫環(huán)境，也會產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)，生成一系列的抗低溫蛋白，即冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）來抵御低溫環(huán)境對菌體造成的損傷[5-8]。這是一類分子量約為7.5 kD的小分子蛋白，CSPs均為誘導(dǎo)型蛋白，在大腸桿菌中（E.coli）發(fā)現(xiàn) 9種 CSPs，其中 CspA、CspB、CspG、CspI 4種可被低溫誘導(dǎo)，其余CSPs在特定的生長期產(chǎn)生，CPSs家族約45%的序列具有同源性[9]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）的CSPs家族具有3種類似CspA的蛋白，分別為CspB、CspC、CspD，3種蛋白均可被低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且是菌體適應(yīng)低溫環(huán)境所必須的[10]。CSPs具有多種生理功能，其結(jié)構(gòu)包含2個(gè)保守的RNA結(jié)合區(qū)域，可結(jié)合RNA或單鏈DNA，可作為RNA的分子伴侶阻止RNA二級結(jié)構(gòu)的形成，并可以作為翻譯的激活因子（Transcription activators）、翻譯抗終止子（Transcription antiterminators）或替代翻譯起始因子（Alternative translation initiation factors），促進(jìn)蛋白的翻譯[9-12]。

本文對保加利亞乳桿菌進(jìn)行低溫處理，以誘導(dǎo)冷休克蛋白的生成，通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法檢測CspA的表達(dá)，確定CspA的最佳誘導(dǎo)條件，并證明菌體的凍融存活率和凍干存活率與CspA的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）GD20150321：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑和儀器

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%、酪蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉粉0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、吐溫-80 0.1%、MgSO40.05%、K2HPO40.05%。用5%的NaOH調(diào)節(jié)pH為6.6～6.8。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂。以上培養(yǎng)基121℃滅菌30 min，至4℃冰箱保存。所有試劑均為分析純。ViiA7型熒光定量PCR儀：美國ABI；Mini-sub cell GT電泳儀：美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的四級發(fā)酵培養(yǎng)

液體發(fā)酵培養(yǎng)采取四級培養(yǎng)的方法，一、二、三級為種子培養(yǎng)基，四級為發(fā)酵培養(yǎng)基，一級種子培養(yǎng)基接入凍干菌種，放置恒溫厭氧培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)12 h。二級種子培養(yǎng)基由培養(yǎng)好的一級種子液按5%的接種量接入，培養(yǎng)8 h。以此類推，傳代到四級發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵液活菌數(shù)的測定

采用平板混菌計(jì)數(shù)法，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）10 倍逐級稀釋發(fā)酵液至 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，然后吸取 1 mL 稀釋液加入到滅菌的空白平皿中，每個(gè)樣平行做3塊平皿，再倒入融化的50℃～55℃MRS固體培養(yǎng)基 15 mL～20 mL，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置放于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》。

1.2.3 保加利亞乳桿菌的生長曲線測定

四級發(fā)酵液按不同的時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h）取樣，平板混菌計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液活菌數(shù)，制作生長曲線。

1.2.4 保加利亞乳桿菌CspA基因的克隆以及RTPCR法檢測mRNA的表達(dá)量

利用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR法檢測CspA基因的引物，引物序列（F：5‘-TTGCCTTGTTCAACATCGTA’，R：5‘-GGGCTTTGGGTTTATCAC-3’），產(chǎn)物長度123bp，引物由Invitrogen公司合成。提取保加利亞乳桿菌總RNA，按 RNAiso Plus（D9108A Takara）試劑盒說明書方法操作，提取得到的RNA溶液，用酶標(biāo)儀檢測OD260與OD280的比值，比值1.8～2.0為符合要求的RNA。

按照PrimeScript RT reagent Kit（DRR037A Takara）試劑盒說明操作，RNA 上樣量為 2.0 μL（約 500 ng），反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s結(jié)束反應(yīng)，獲得cDNA。

熒光定量PCR，按照SYBRPremixExTaq（DRR041A Takara）說明書方法操作，以cDNA為模板，加入CspA的引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time PCR，RTPCR）方法擴(kuò)增CspA基因。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃5 s，退火60℃34 s讀板，共40個(gè)循環(huán)；從65℃到95℃制作融解曲線。以16srDNA為內(nèi)參基因（長度210 bp），以確定CspA的相對表達(dá)量。產(chǎn)物做電泳檢測分析，并測序分析。

1.2.5 保加利亞乳桿菌低溫誘導(dǎo)CspA試驗(yàn)

將保加利亞乳桿菌四級發(fā)酵液分別置于5、10、15、20、37 ℃的恒溫水浴中分別處理 0.5、1、2、4、6 h，即按照5組（溫度）×5組（時(shí)間）設(shè)計(jì)，共25組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃為對照組。RT-PCR法檢測CspA的表達(dá)量。

1.2.6 反復(fù)凍融法測定低溫誘導(dǎo)后保加利亞乳桿菌的存活率

將保加利亞乳桿菌四級發(fā)酵液分別置于10、15、20、37 ℃的恒溫水浴中分別處理 1、2、4、6 h，即按照 4組（溫度）×4組（時(shí)間）設(shè)計(jì)，共16組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃為對照組。并將菌液于-20℃以及25℃反復(fù)凍融8次，平板混菌計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，計(jì)算凍融存活率（凍融后的活菌數(shù)/凍融前的活菌數(shù)）。

1.2.7 保加利亞乳桿菌凍干驗(yàn)證試驗(yàn)

保加利亞乳桿菌四級發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集菌體，加入凍干保護(hù)劑（凍干保護(hù)劑：25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸）混勻，-40℃預(yù)冷30 min，真空干燥24 h得到凍干菌粉。精密稱取1.00 g菌粉懸溶于10 mL PBS中混勻，平板混菌計(jì)數(shù)法測定混懸液的活菌數(shù)。為了考察低溫誘導(dǎo)和凍干保護(hù)劑對菌體抗凍性的影響，發(fā)酵液按照最佳溫度和時(shí)間進(jìn)行低溫誘導(dǎo)處理，試驗(yàn)分為4組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。（A）空白對照組、（B）加保護(hù)劑組、（C）低溫誘導(dǎo)組、（D）保護(hù)劑+低溫誘導(dǎo)組，計(jì)算各組樣品的凍干存活率（凍干菌粉總活菌數(shù)/發(fā)酵液總活菌數(shù)）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

RT-PCR所獲得的數(shù)據(jù)，利用2-ΔCt（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)）（ΔCt=CspA Ct值－16srDNA Ct值）公式進(jìn)行 CspA基因在保加利亞乳桿菌中相對表達(dá)量計(jì)算。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示，應(yīng)用Tukeytest檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 保加利亞乳桿菌生長曲線結(jié)果

保加利亞乳桿菌生長曲線如圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus

如圖1所示，保加利亞乳桿菌生長良好，0～2 h是菌體的適應(yīng)期，2 h～6 h是菌體的對數(shù)生長期，6 h～12 h是菌體的穩(wěn)定生長期，12 h～20 h菌體進(jìn)入衰退期。

2.2 保加利亞乳桿菌CspA基因克隆及電泳結(jié)果

保加利亞乳桿菌CspA基因克隆電泳結(jié)果見圖2。

圖2CspA基因RT-PCR電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of CspA RT-PCR product

如圖2所示保加利亞乳桿菌CspA基因克隆片段，大小為123 bp，產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、測序、測序結(jié)果在Genbank上比對，確認(rèn)為目標(biāo)基因。

2.3 保加利亞乳桿菌低溫誘導(dǎo)CspA試驗(yàn)結(jié)果

低溫誘導(dǎo)后CspA mRNA的相對表達(dá)量見圖3。

圖3 低溫誘導(dǎo)后CspA mRNA的相對表達(dá)量Fig.3 Relative mRNA expression of CspA after low temperature treatment

如圖3所示，保加利亞乳桿菌四級發(fā)酵液在不同的誘導(dǎo)溫度（5、10、15、20℃）條件下，以及不同的誘導(dǎo)時(shí)間（0.5、1、2、4、6 h）條件下，并以 37 ℃作為對照，RT-PCR法檢測菌體CspA mRNA的表達(dá)量。用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在37℃時(shí)，不同的時(shí)間內(nèi)其表達(dá)量沒有顯著變化，說明時(shí)間不會對CspA mRNA的表達(dá)量造成影響。而在低溫誘導(dǎo)下，菌體CspA mRNA的表達(dá)量均有不同程度的提高，說明低溫可以誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生CspA，且在20℃誘導(dǎo)4 h，菌體CspA的表達(dá)量最高，且差異顯著（P＜0.01）。

2.4 反復(fù)凍融法測定低溫誘導(dǎo)后保加利亞乳桿菌的存活率結(jié)果

不同誘導(dǎo)時(shí)間和溫度條件下，低溫誘導(dǎo)后菌體的凍融存活率見圖4。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度條件下菌體的凍融存活率Fig.4 Freeze-thawing survival rate of cells after low temperature treatment with the condition of different administration time

保加利亞乳桿菌四級發(fā)酵液在不同的誘導(dǎo)溫度（10、15、20℃）條件下，以及不同的誘導(dǎo)時(shí)間（1、2、4、6 h）條件下，并以37℃作為對照組，平板計(jì)數(shù)法檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，并計(jì)算凍融存活率。用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如圖4所示，在37℃時(shí)，菌體的存活率隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加而顯著降低，經(jīng)過8次凍融循環(huán)后，菌體存活率為14%，差異顯著（P<0.01）。而在低溫誘導(dǎo)下，菌體的凍融存活率明顯高于對照組，說明低溫誘導(dǎo)可以明顯提高菌體的抗凍性，并且在20℃、4 h條件下菌體的凍融存活率最高，經(jīng)過8次凍融循環(huán)后，存活率達(dá)64%，差異顯著（P<0.01）。

2.5 保加利亞乳桿菌凍干驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在保加利亞乳桿菌凍干過程中通常需要加入一定量的保護(hù)劑，以減輕凍干對菌體的損傷，為了考察CspA對菌體凍干的保護(hù)效果，以及CspA與凍干保護(hù)劑對菌體凍干的協(xié)同保護(hù)作用，將試驗(yàn)分為4組，A空白對照組、B加保護(hù)劑組、C低溫誘導(dǎo)組、D保護(hù)劑+低溫誘導(dǎo)組，以A組為對照，對比其它組的凍干相對存活率。平板計(jì)數(shù)法檢測凍干菌粉的活菌數(shù)，并計(jì)算凍干存活率。用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果見圖5。

圖5 菌體凍干存活率驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Testify result of freeze-drying survival rate of cells

如圖5所示，A組的凍干存活率約為12%；B組加入凍干保護(hù)劑后其相對凍干存活率約為32%，說明凍干保護(hù)劑對菌體的存活率起到了明顯的效果；C組中菌體經(jīng)低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生CspA后，其凍干存活率約為29%，說明CspA可以保護(hù)菌體減少凍干對菌體的損傷；D組加入凍干保護(hù)劑并低溫誘導(dǎo)菌體，其凍干存活率約為57%，差異顯著（P<0.01），說明凍干保護(hù)劑和CspA具有協(xié)同或相加的作用，共同保護(hù)菌體，提高了菌體的抗凍性。

3 討論

冷休克蛋白在細(xì)胞水平上發(fā)揮了重要作用，CspA的mRNA能在低溫條件下表達(dá)，并且翻譯出CspA蛋白，CspA可作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，并且CspA還可結(jié)合單鏈DNA及RNA，從而影響其基因表達(dá)功能[1，13-15]。研究顯示，對嗜熱鏈球菌進(jìn)行20℃、4 h的低溫處理，其存活率可提高1 000倍[16-17]。枯草芽孢桿菌經(jīng)18℃低溫處理后，有大約50種參與氨基酸與核酸合成的mRNA的表達(dá)降低，同時(shí)約50中mRNA的表達(dá)升高，表達(dá)最強(qiáng)的是脂肪酸脫氫酶基因，其作用是將飽和脂肪酸脫氫成為不飽和脂肪酸，增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高抗凍性。

本研究對保加利亞乳桿菌進(jìn)行不同溫度和時(shí)間的低溫處理，以考察CspA的最佳誘導(dǎo)條件，并考察菌體的凍融存活率和凍干存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20℃、4 h誘導(dǎo)條件下其CspA的表達(dá)量最高，且低溫誘導(dǎo)可以顯著提高保加利亞乳桿菌的凍融存活率和凍干存活率，說明CspA在抵御低溫對菌體的損傷、提高凍融存活率和凍干存活率方面發(fā)揮了重要作用。由此可知，在發(fā)酵結(jié)束后，對保加利亞乳桿菌進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，促進(jìn)其CspA的表達(dá)，可以明顯提高菌體的凍干存活率，提高凍干菌粉的活菌數(shù)，對于菌粉的工業(yè)生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

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