羅曉星

(解放軍第458醫(yī)院，廣東 廣州 510062)

急性心肌梗死(AMI)發(fā)生后，由于心室肌在缺血、缺氧等損害因素的持續(xù)作用下，導致左心室形態(tài)和大小的改變稱為左室重構(LVR)。LVR的發(fā)生不僅導致AMI患者的心臟功能嚴重受損，還直接影響預后。因此，能夠早期發(fā)現、預測AMI患者發(fā)生LVR，對于及時治療或延緩LVR的發(fā)生、改善AMI患者預后具有非常重要的意義[1]。MicroRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物細胞中的一類內源性的、非編碼的單鏈小分子RNA，具有調控多個上游基因表達和下游蛋白翻譯的能力[2]，因而在多種生理病理過程起著非常重要的作用。miR-208是在心肌組織中特異性表達的miRNA，其與心臟的發(fā)育等生理病理過程密切相關[3-4]。大規(guī)模、多中心臨床實驗發(fā)現miR-208是影響AMI患者心源性死亡和心臟衰竭的獨立危險因素[5-6]。目前對miR-208a與AMI后LVR相關性以及相關機制的研究較少，臨床上用于診斷AMI患者發(fā)生LVR的血清學指標尚無統(tǒng)一標準。本研究通過檢測AMI患者血清miR-208a水平，研究其與AMI患者發(fā)生LVR的相關性，初步探討血清miR-208a對AMI患者近期發(fā)生LVR的預測價值。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2013年1月—2015年1月我院心血管內科和干部病房診治的明確診斷為AMI患者60例，其中男48例，女12例；年齡(47.9±6.5)歲。均符合中華醫(yī)學會心血管病分會制定的AMI診斷標準，首次發(fā)作，在發(fā)病后24 h內入院；患者及其家屬明確知曉且簽署知情同意書，且經醫(yī)學倫理委員會批準。排除其他各種原因導致的非AMI性心臟疾病者；合并腦、肺、肝、腎嚴重疾病者；合并晚期惡性腫瘤者；嚴重急慢性感染性疾病者；意識或精神原因不能配合者。另選擇同期30例健康體檢者作為健康對照組，男22例，女8例；年齡(45.3±5.9)歲，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1超聲數據檢測采集 分別于入院時及發(fā)病后6個月采用PHILIPS IE33彩色多普勒超聲診斷儀進行超聲數據檢測采集。受檢者左側臥位，在二維圖像下獲得心臟左室胸骨旁長軸在二尖瓣腱索水平的M型圖像，于呼氣末期測出舒張末期(QRS波起點)左室舒張末內徑(EDD)、左室后壁厚度(LVPWT)和室間隔厚度(IVST)，測量5個心動周期取平均值。根據Devereux公式[7]計算左室質量(LVM)和左室質量指數(LVMI)，根據發(fā)病6個月后LVMI將AMI患者分為左室重構組34例和非左室重構組26例。LVM=1.04×[(EDD+IVST+LVPWT)3-EDD3]-13.6(g)；LVMI=LVM/BSA(體表面積)(g/m2)。BSA=[0.006×身高(cm)+0.012 8×體質量(kg)]-0.152 9。LVR診斷標準：LVMI≥125 g/m2(男性)或≥120 g/m2(女性)。

1.2.2血清樣本采集 采集AMI患者發(fā)病后24 h內外周靜脈血5 mL，健康對照組取空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，置于4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，集中統(tǒng)一編號后置于-80 ℃冰箱待測。

1.2.3實時熒光定量PCR ①血清總RNA提取：采用Trizol試劑對血清總RNA進行提取。經過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后，RNA電泳檢測提取RNA分子的完整性，Nanodrop? ND-1000測定提取RNA的濃度。②逆轉錄(RT)反應：按照miScript Reverse Transcription Kit操作步驟構建10 μL反應體系，即RNA 3 μL， 1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，mirVana RT Buffer(5×)2 μL，加RNase-free water至總體積10 μL。反應條件：37 ℃，15 min；42 ℃，50 min；85 ℃，5 min。③實時熒光定量PCR反應：按照miRNA SYBR Green PCR Kit 操作步驟構建20 μL反應體系，即5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL， PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板1～2.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加入ddH2O至總體積20 μL。 反應條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個PCR循環(huán)。反應結束后分析PCR反應曲線，根據實時熒光定量PCR得出miRNA-208a與U6從基線到指數增長的拐點所對應的循環(huán)次數(CT值)，采用2-ΔΔCT法對miR-21表達相對值進行分析。miR-208a正向引物序列：F-TGCGGTATAAGACGAGCAAA。

2 結 果

2.1AMI患者miR-208a表達水平 健康對照組人群血清miR-208a相對表達水平為0.177±0.034， AMI患者發(fā)病后24 h內血清miR-208a相對表達水平為1.405±0.295，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。左室重構組患者AMI發(fā)病后24 h內血清miR-208a相對表達水平為1.728±0.314，而非左室重構組患者AMI發(fā)病后24 h內血清miR-208a相對表達水平為1.086±0.289，2組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2miR-208a表達水平與LVR相關性 Pearson相關分析結果顯示，miR-208a水平與LVMI間呈正相關(r=0.539，P<0.05)。見圖1。

圖1 血清miR-208a表達水平與左室重構程度相關性

2.3血清miR-208a表達水平對LVR的預測價值以AMI患者的LVMI為因變量，血清miR-208a表達水平作為自變量進行線性回歸分析。結果顯示血清miR-208a表達水平與LVR具有相關性(B=0.205，OR=0.930，P=0.01)，血清miR-208a表達水平越高，AMI患者發(fā)生LVR的可能性越大。

2.4血清miR-208a表達水平對LVR的診斷效能ROC曲線分析結果顯示，miR-208a曲線下面積(AUC)為0.73(P<0.001)；取相對表達值1.704為截斷點，血清miR-208a預測AMI患者發(fā)生LVR的靈敏度為82.64%，特異度為77.42%。見圖2。

3 討 論

AMI后患者發(fā)生LVR的具體機制十分復雜，已知與心肌細胞的凋亡、神經內分泌系統(tǒng)激活、免疫系統(tǒng)活化、細胞因子釋放、相關信號通路激活和基因的異常表達等有關，目前尚未完全明確。據多個臨床研究中心長期隨訪研究發(fā)現，LVR能夠較為敏感地反映AMI發(fā)生后患者心功能情況，也是影響AMI患者遠期發(fā)生心源性死亡的重要危險因素[8-9]。目前國內外醫(yī)學界針對預測AMI后患者發(fā)生LVR的獨立和敏感地血清標志物已開展了大量的研究，也取得了一定的成果。Dominguez等[10]對一組161例AMI患者進行前瞻性調查研究發(fā)現，AMI后發(fā)生LVR患者血清中褪黑素水平明顯低于未發(fā)生LVR的患者。多元分析提示血清褪黑素水平是預測AMI后患者發(fā)生LVR的獨立預測因子。Fertin等[11]通過對246例AMI研究發(fā)現，AMI患者血清MMP-8水平與左心室舒張末期容積(LVEDV)呈明顯正相關；進一步單因素和多因素分析顯示，血清MMP-8水平是AMI后發(fā)生LVR的獨立預測指標。郭潮等[12]研究發(fā)現，AMI患者血清生長分化因子-15(GDF-15)水平與LVMI呈明顯正相關，而與射血分數、相對室壁厚度呈明顯負相關；提示血清GDF-15水平能反映AMI患者LVR程度。雖然已經有多個能夠反映AMI后發(fā)生LVR的標志物，但這些標志物對LVR的預測價值存在一定的局限性。因此，如何針對AMI后患者發(fā)生LVR的相關機制進行深入研究，以及針對機制尋找能夠較早的預測LVR的獨立標志物和開發(fā)特效新藥，仍然是目前臨床醫(yī)學界研究的重點。

圖2 血清miR-208a的ROC曲線

miRNA是近年來新發(fā)現的一類內源性非編碼的短鏈小RNA分子，其主要通過與目標mRNA 3’端非編碼區(qū)相互補匹配(完全互補或者幾乎完全互補)，在轉錄后調控目標基因。研究證實miRNA具有調控多個靶點基因的能力，其在機體的多種生理病理過程起著非常重要的調控作用[13]。由于miRNA在組織循環(huán)中相對穩(wěn)定又具有生物遺傳和種屬表達保守性的特點，因此，醫(yī)學上針對miRNA開展了一系列疾病監(jiān)測和靶向治療研究。

miR-208a為在心肌組織中特異性表達的miRNA。生理情況下，miR-208a在心肌干細胞的分化、心肌細胞肌球蛋白含量、肌纖維的成分及心肌細胞收縮性能上起著重要的調控作用[3]。病理情況下，心肌細胞中miR-208a的表達失調則與心肌膠原的堆積、心肌重構、心肌肥大、心律失常等心臟損傷過程密切相關[14-15]。且由于miR-208a具有高度組織特異性，目前很多研究認為心肌組織中異常高表達的miR-208a是一個強有力的預測心臟衰竭和心源性死亡的分子指標[16]。

本研究顯示，AMI患者血清miR-208a表達水平顯著高于健康對照組，這與國內外相關研究數據是一致的[17]。左室重構患者血清miR-208a表達水平顯著高于非左室重構患者。Pearson相關分析顯示，血清miR-208a水平與LVMI間呈顯著正相關。線性回歸分析顯示血清miR-208a水平與LVR具有獨立相關性。以上研究結果提示血清miR-208a表達水平越高，AMI患者發(fā)生LVR的可能性也越大，即高表達的血清miR-208a 是AMI患者發(fā)生LVR 的獨立預測因子。

為研究miR-208a對AMI后患者發(fā)生LVR的診斷效能，本研究以反映左室重構程度的LVMI為因變量，對血清miR-208a水平進行ROC曲線分析。ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，其曲線下面積越大診斷準確性越高。結果顯示，miR-208a曲線下面積為0.73(P<0.001)；取相對表達值1.704為截斷點，血清miR-208a預測AMI患者發(fā)生LVR的靈敏度為82.64%，特異度為77.42%。可見血清miR-208a對AMI后發(fā)生LVR具有較高的診斷價值。

綜上可見，血清miR-208a與AMI后LVR的發(fā)生具有相關性，具有作為預測AMI后發(fā)生LVR的分子標志物的條件。但需進一步進行大樣本及延長隨訪時間來進行驗證研究。此外，尚需要更多的基礎及臨床試驗進一步驗證及闡明其相關機制。

[1] Skalicka HJ,Horak J,Aschermann M,et al. Myocardial infarction,left ventricle remodeling and cellular therapy[J]. Vnitr Lek,2009,55(1):37-44

[2] David R. Small RNAs:miRNA machinery disposal[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):4-5

[3] Callis TE，Pandya K,Seok HY,et al. MicroRNA-208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice[J]. J Clin Invest,2009,119(9):2772-2786

[4] Wang BW,Wu GJ,Cheng WP,et al. Mechanical stretch via transforming growth factor-beta1 activates microRNA-208a to regulate hypertrophy in cultured rat cardiac myocytes[J]. J Formos Med Assoc,2013,112(10):635-643

[5] Wang BW,Wu GJ,Cheng WP,et al. MicroRNA-208a increases m-yocardial fibrosis via endoglin in volume overloading heart[J]. PLoS One,2014,9(1):e84188

[6] Shyu KG,Wang BW,Cheng WP,et al. MicroRNA-208a Increases Myocardial Endoglin Expression and Myocardial Fibrosis in Acute Myocardial Infarction[J]. Can J Cardiol,2015,31(5):679-690

[7] Massabuau P,Fourcade J,Galinier M,et al. Ambulatory blood p-ressure monitoring and left ventricular hypertrophy: correlations and trial of predictive value[J]. Arch Mal Coeur Vaiss,1992,85(8):1173-1175

[8] Kleczynski P,Legutko J,Rakowski T,et al. Predictive utility of NT-pro BNP for infarct size and left ventricle function after acute myocardial infarction in long-term follow-up[J]. Dis Markers,2013,34(3):199-204

[9] Szydlo K,Wita K,Trusz-Gluza M,et al. Late phase of repolarization(Tpeak Tend) as a prognostic marker of left ventricle remodeling in patients with anterior myocardial infarction treated with primary coronary intervention[J]. Cardiol J,2010,17(3):244-248

[10] Dominguez-Rodriguez A,Abreu-Gonzalez P,Arroyo-Ucar E,et al. Decreased level of melatonin in serum predicts left ventricular remodelling after acute myocardial infarction[J]. J Pineal Res,2012,53(3):319-323

[11] Fertin M,Lemesle G,Turkieh A,et al. Serum MMP-8:a novel indicator of left ventricular remodeling and cardiac outcome in patients after acute myocardial infarction[J]. PLoS One,2013,8(8):e71280

[12] 郭潮，牛凡. 血清生長分化因子-15與急性心肌梗死后左室重構程度的相關性[J]. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2012,10(9):1055-1056

[13] Ishida M,Selaru FM. miRNA-based therapeutic strategies[J]. Curr Anesthesiol Rep,2013,1(1):63-70

[14] Meng LD,Meng AC,Zhu Q,et al. Effect of microRNA-208a on mitochondrial apoptosis of cardiomyocytes of neonatal rats[J]. Asian Pac J Trop Med,2015,8(9):747-751

[15] Nattel S. Targeting MicroRNA-208a to Suppress adverse postmyocardial infarction remodelling related to RNA activation of endoglin gene expression[J]. Can J Cardiol,2015,31(5):591-592

[16] Shyu KG,Wang BW,Cheng WP,et al. MicroRNA-208a increases myocardial endoglin expression and myocardial fibrosis in acute myocardial infarction[J]. Can J Cardiol,2015,31(5):679-690

[17] Xiao J,Shen B,Li J,et al. Serum microRNA-499 and microRNA-208a as biomarkers of acute myocardial infarction[J]. Int J Clin Exp Med,2014,7(1):136-141