尹鵬 胡君 儲著凌 侯樂偉 宋博 欒榮剛 胡國強(qiáng)(解放軍第四五四醫(yī)院燒傷整形外科, 江蘇 南京 210002)

大量臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn), 胃癌由于高幽門螺桿菌感染率、人口老齡化及食物添加劑如亞硝酸鹽攝入過多等因素, 在我國仍是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤[1-4]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示每年全世界估計(jì)有90萬胃癌新發(fā)病例, 同時死亡人數(shù)約為70萬[1-4]?？吕锢┯址Q柯子次鞣素, 在老鸛草和葉下珠等中藥中含量較為豐富, 作為植物多酚單寧酸類化合物具有包括抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抑制肝臟纖維化以及抑制多種腫瘤增殖和分化等藥理作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1信號通路是一個高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 一方面參與了胚胎發(fā)育、機(jī)體生長和細(xì)胞凋亡等生理過程；另一方面, 大量研究證實(shí)NOTCH1信號通路在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及血管生成的調(diào)控過程中扮演了重要的角色[8-9]。目前研究證實(shí)柯里拉京可以通過調(diào)控NOTCH1信號通路抑制膽管細(xì)胞癌的增殖和分化[10]。故本研究擬觀察柯里拉京對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響及對NOTCH1信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 胃癌SGC-7901細(xì)胞購買于從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫, qPCR試劑盒購自寶生物工程有限公司, 鼠抗人NOTCH1抗體、鼠抗人Hes1抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruze公司, 柯里拉京購買于美國Invitrogen公司, DMEM培養(yǎng)基和小牛血清均購買于杭州四季清公司, MTT試劑盒購買于美國Promega公司, 超純水, 其余試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細(xì)胞常規(guī)接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中, 置于37°C、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48h換液、傳代1次, 取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液, 接種于96 孔培養(yǎng)板中, 每孔接種100 μL約含5×103個細(xì)胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞12～24h, 使細(xì)胞同步化。加入不同終濃度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)的柯里拉京, 在37°C, 5 % CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞, 0μg/ml的柯里拉京干預(yù)組細(xì)胞作為陰性對照組(Control組)。使用MTT比色試驗(yàn)對不同時間點(diǎn)(0、24、48 h)的細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行測定, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對應(yīng)時間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%)=(OD干預(yù)組/OD對照組) × 100 (%)[11]。

1.4 qPCR法檢測細(xì)胞NOTCH1和Hes1 mRNA表達(dá)水平 采用qPCR測定NOTCH1和Hes1的mRNA表達(dá)水平, β-actin為內(nèi)參, 按照PCR試劑盒說明書提取總RNA。采用PrimerScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用iQ 5多色實(shí)時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)和熒光定量PCR試劑盒用于擴(kuò)增, 使用β-actin作為內(nèi)參照。引物和探針使用Primer Premier設(shè)計(jì)。引物序列如下: NOTCH1正義5'-GGGT CCACCAG TTTGAATGG-3', 反義5'-GTTTG CTGGCT GCAG GTTCT-3'；Hes1正義 5'-TATCATGGAG AAGAGGCGAAGG-3', 反義5'-TTCTCTAG CTTGGAATGCCGG-3'；β-actin正義: 5'-CTCCATCCT GGCCTCGCTGT-3', 反義: 5'-GCTGTCACC TTCAC CGTTCC-3'。使用2ΔΔCt法對NOTCH1和Hes1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定, ΔΔCt=(Ct,目標(biāo)Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)Ct,β-actin)對照組[12]。

1.5 Western blot法檢測細(xì)胞中NOTCH1和Hes1蛋白表達(dá) 按照試劑盒操作步驟, 首先提取細(xì)胞總蛋白, 并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上, 用脫脂奶粉封閉1 h, 分別加入鼠抗人單克隆抗體NOTCH1 (1: 800)、Hes1 (1: 800)和β-actin (1: 1200), 4℃孵育過夜, 洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1: 2000), ECL進(jìn)行顯色, 采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度分析, β-actin作為內(nèi)參, 使用NOTCH1/β-actin和Hes1/β-actin的比值進(jìn)行比較[13]。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度柯里拉京干預(yù)胃癌SGC-7901細(xì)胞活性比較 給予不同濃度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)的柯里拉京干預(yù)后, 使用MTT法對不同時間點(diǎn)(0、24、48 h)胃癌SGC-7901細(xì)胞活性進(jìn)行檢測?？吕锢└深A(yù)后SGC-7901細(xì)胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性降低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 不同濃度柯里拉京干預(yù)SGC-7901細(xì)胞活性比較Table 1 Cell viabilities of SGC-7901 cells in different time points

注: 對應(yīng)時間點(diǎn)與0μg/ml比較， ①P<0.05；對應(yīng)時間點(diǎn)與10μg/ml比較, ②P<0.05

2.2 SGC-7901細(xì)胞NOTCH1 mRNA和蛋白的表達(dá) 在給予SGC-7901細(xì)胞不同濃度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)柯里拉京干預(yù)48h后, 采用qPCR和western blot法對SGC-7901細(xì)胞NOTCH1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析?？吕锢└深A(yù)后NOTCH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性下降, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1、表2。

圖1 SGC-7901細(xì)胞NOTCH1蛋白的表達(dá)Figure 1 The protein expression of NOTCH1 in SGC-7901 cells

Table2ThemRNAandproteinexpressionlevelsofNOTCH1andHes1inSGC-7901cells

濃度(ug/ml)NOTCH1mRNANOCTH1蛋白Hes1mRNAHes1蛋白01．000 98±0 021．000 96±0 04100 71±0 12①0 66±0 15①0 53±0 17①0 61±0 13①1000 31±0 07①②0 24±0 06①②0 23±0 05①②0 26±0 07①②

注: 與0μg/ml相比較, ①P<0.05； 與10μg/ml相比較, ②P<0.05

2.3 Hes1 mRNA和蛋白的表達(dá) 在給予SGC-7901細(xì)胞不同濃度(0μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)柯里拉京干預(yù)48h后, 采用qPCR和western blot法對SGC-7901細(xì)胞Hes1 mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析?？吕锢└深A(yù)后Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性降低, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05), 見圖2、表2。

圖2 SGC-7901細(xì)胞Hes1蛋白的表達(dá)Figure 2 The protein expression of Hes1 in SGC-7901 cells

3 討論

胃癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一, 研究表明在成年人中胃癌已成為中國發(fā)病率第二的惡性腫瘤, 同時也是導(dǎo)致我國成人因惡性腫瘤死亡的第三大原因[1-4, 14-15]。在全球范圍內(nèi)東亞地區(qū)的胃癌發(fā)病率最高, 患病人數(shù)超過全球總患病人數(shù)的一半[1-4, 14]。大量研究發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)病與基因突變、幽門螺桿菌感染(helicobacterpyloriinfection)、飲食結(jié)構(gòu)、人口老齡化及食物添加劑如亞硝酸鹽攝人過多等因素密切相關(guān)[1-4, 14]。因此尋求新的治療藥物和方法對于臨床治療胃癌將會有重要的價值和意義。

柯里拉京是中草藥老鸛草和葉下珠的主要藥理成分, 其屬于酚單寧酸類化合物。有研究表明柯里拉京對于炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤的分化和增殖、氧化應(yīng)激等病理和生理過程均有調(diào)控作用, 同時研究還發(fā)現(xiàn)柯里拉京具有抑制細(xì)菌和病毒等病原體生長的藥理作用[5-7, 16]。Gu Y等的研究證實(shí)柯里拉京可有效抑制膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和分化并可促進(jìn)腫瘤的凋亡[16]。Jia L等的研究還發(fā)現(xiàn)柯里拉京對卵巢癌SKOv3ip細(xì)胞和Hey細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果表明柯里拉京對胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖和分化有顯著的抑制作用。

NOTCH1基因及其信號通路在進(jìn)化上及其保守, 廣泛存在于低等和高等動物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1信號通路在生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的調(diào)控、腫瘤的轉(zhuǎn)移、分化和血管生成以及器官纖維化等生理和病理過程中扮演著重要的角色[8-9, 18-20]。Sawaguchi S等[18]人的研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1信號通路對于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及血管再生的出芽過程有重要的調(diào)控作用。Zhou Y等[19]人發(fā)現(xiàn)黃芪注射液(Astragalus injection)可以通過下調(diào)Jagged1/Notch1信號通路減輕博萊霉素(bleomycin)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化。Li Y等的研究證實(shí)miR-375、miR-30a和miR-34a可以通過Presenilin/Notch1信號通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞的凋亡[20]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑DAPT對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用與調(diào)控NOTCH1/Hes1信號系統(tǒng)明確相關(guān)[8]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hes1是NOTCH1信號通路重要的下游分子, Hes1作為信號通路中間分子對于下游的NF-κB和SOX2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有關(guān)鍵的調(diào)控作用[21-22]。Batchuluun K等[21]的研究顯示在大鼠垂體細(xì)胞中NOTCH1/Hes1信號通路對于轉(zhuǎn)錄因子SOX2的合成有關(guān)鍵的調(diào)控價值。Zhang Q等[22]的研究證實(shí)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中NOTCH1/Hes1信號通路對于NF-κB的活化具有重要的調(diào)控作用。本研究中我們發(fā)現(xiàn)在給予胃癌SGC-7901細(xì)胞柯里拉京干預(yù)后NOTCH1 和Hes1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈濃度依賴性降低, 差異均存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果提示柯里拉京對胃癌SGC-7901細(xì)胞NOTCH1和Hes1基因的表達(dá)有顯著的抑制作用。

4 結(jié)論

柯里拉京可通過下調(diào)NOTCH1/Hes1信號通路抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖, 同時為柯里拉京應(yīng)用于臨床治療胃癌等惡性腫瘤奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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