王百川，傅澤田，張小栓，孔維府，徐榕雪，宮祥博

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院，山東 煙臺 264000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100068)

蘋果醋，是指以蘋果汁發(fā)酵而成的蘋果原醋，再兌以蘋果汁等原料而成的飲品。蘋果醋含有維他命、礦物質(zhì)及酵素，其酸性成分能疏通軟化血管、殺滅病菌、增強(qiáng)人體的免疫力和抗病毒能力、改善消化系統(tǒng)等。由于蘋果醋有美容養(yǎng)顏、減肥的功效，所以近幾年來廣受大眾的喜愛。但一些不法商販在蘋果醋中加入西布曲明及其去甲基衍生物等化學(xué)藥品提高其減肥效果。若消費(fèi)者在不知情的情況下，大量飲用含有西布曲明及其衍生物的蘋果醋，會引起血壓升高、心率加快、厭食、失眠、肝功能異常等嚴(yán)重后果。目前，對西布曲明及其衍生物的檢測報道較少，楊春華等[1]采用甲基化將西布曲明衍生至其代謝物的方法測定了西布曲明及其代謝物的總量；陳稚等[2]采用HPLC-ESI-MS單級質(zhì)譜法測定保健品中N，N-雙去甲基西布曲明。目前，針對蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的檢測尚未見報道。本試驗建立了液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法檢測蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物，在國內(nèi)尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

乙腈：色譜純，F(xiàn)isher Chemical 提供，批號：75-05-8；甲醇：色譜純，Dikma 提供，批號：67-56-1； 乙酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供，批號：20140421；乙酸銨：優(yōu)級純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供，批號：50166。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

西布曲明：中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100624-200401，純度：99%；N,N-雙去甲基西布曲明：中國食品藥品檢定研究院提供，批號：520002-201301，純度：98.5%；

N-單去甲基西布曲明：中國食品藥品檢定研究院提供，批號：520001-201301，純度：99%。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：A：乙腈，B：含0.1%乙酸的10 mmol/L乙酸銨；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200 質(zhì)譜儀：質(zhì)譜參數(shù)：ESI正離子模式。離子源參數(shù)見表2。

表2 離子源參數(shù)Table 2 Ion source parameters

掃描模式：多反應(yīng)檢測(MRM)。多反應(yīng)檢測模式見表3。

表3 多反應(yīng)檢測模式Table 3 MRM mode

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

精密稱取10 mg西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液的制備

分別吸取0.4 mL的儲備液至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液的配制

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫后4500 r/min離心10 min。取上清溶液50 μL，加甲醇稀釋至1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜即得西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明濃度范圍為2，4，8，12，16，24 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品制備

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫，4500 r/min 離心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，搖勻，上清液過0.22 μm膜，備用。

1.7 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫，4500 r/min離心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，搖勻。用空白樣品溶液將此溶液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根據(jù)色譜圖測得信噪比，按S/N=3∶1，S/N=10∶1，計算檢出限和定量限。

1.8 方法的準(zhǔn)確性

低濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成4 ng/mL的質(zhì)控樣品。

中濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成8 ng/mL的質(zhì)控樣品。

高濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成16 ng/mL的質(zhì)控樣品。

1.9 精密度

稱取3份0.3 g空白樣品于3個10 mL容量瓶中，每瓶分別加入標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液10，20，40 μL，按樣品制備方法操作得供試品溶液，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，計算試樣中西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明含量及其RSD值，得精密度結(jié)果。

1.10 重復(fù)性

取濃度為2，4，8 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各6份，經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度及其RSD，得重復(fù)性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液，按上述方法進(jìn)行前處理，即得西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明濃度范圍為2，4，8，12，16，24 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10 mL混標(biāo)注入LC-MS/MS中，測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和線性范圍。

圖1 西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of sibutramine

圖2 N-單去甲基西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of N-desmethyl sibutramine

圖3 N,N-雙去甲基西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of N,N-di-desmethyl sibutramine

由圖1～圖3可知，西布曲明及其去甲基衍生物在濃度2～24 ng/mL的濃度范圍內(nèi)r值依次為0.9994，0.9998，0.9999，均大于0.99，表明西布曲明及其去甲基衍生物在上述線性范圍良好，選取2～24 ng/mL為本試驗的線性范圍。

2.2 專屬性、檢出限和定量限

目標(biāo)化合物出峰處無干擾，一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖應(yīng)清晰可見。

采用空白樣品加標(biāo)的方法測定[3-7]，精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，按上述方法進(jìn)行前處理，得空白樣品溶液。用空白樣品溶液將混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。

西布曲明的方法檢出限為15.8 μg/kg，定量限為49.5 μg/kg。N,N-雙去甲基西布曲明的方法檢出限為58.6 μg/kg，定量限為195.4 μg/kg。N-單去甲基西布曲明的方法檢出限為18.0 μg/kg，定量限為61.2 μg/kg。

圖4 西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明一級質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectra of sibutramine, N-desmethyl sibutramine,N,N-di-desmethyl sibutramine

圖5 N，N-雙去甲基西布曲明二級質(zhì)譜圖Fig.5 MS2 spectra of N,N-di-desmethyl sibutramine

圖6 西布曲明二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS2 spectra of sibutramine

圖7 N-單去甲基西布曲明二級質(zhì)譜圖Fig.7 MS2 spectra of N-desmethyl sibutramine

由圖5～圖7可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明二級質(zhì)譜圖結(jié)果一致，可能的原因是鄰近N原子的C-C鍵容易發(fā)生α斷裂，N原子所在的基團(tuán)形成中性丟失，這與沈國芳、朱建所得結(jié)論一致。

2.3 方法的準(zhǔn)確性

采用空白樣品加標(biāo)回收法測定，取濃度分別為4，8，16 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品3份經(jīng)前處理進(jìn)樣分析，每種濃度平行進(jìn)樣3針，測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度，除以理論加入濃度，得方法回收率，即準(zhǔn)確度結(jié)果。

表4 不同濃度下的西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 4 Recoveries of sibutramine at different concentration levels(n=3)

表5 不同濃度下 N，N-雙去甲基西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 5 Recoveries of N,N-di-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

表6 不同濃度下N-單去甲基西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 6 Recoveries of N-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

由表4～表6可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明在高、中、低3個水平回收率均在80%～110%之間。低濃度回收率略低，隨著濃度的增大，回收率接近100%，這是因為在低水平時，系統(tǒng)誤差較大，隨著濃度的增加，系統(tǒng)誤差逐漸變小。

2.4 方法的重復(fù)性

表7 重復(fù)性測定結(jié)果(西布曲明) Table 7 Repeatability(RSD)of sibutramine

表8 重復(fù)性測定結(jié)果(N-單去甲基西布曲明)Table 8 Repeatability(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表9 重復(fù)性測定結(jié)果(N,N-雙去甲基西布曲明)Table 9 Repeatability(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取濃度為4 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各6份經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。由表7～表9可知重復(fù)性RSD小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 方法的精密度

表10 精密度測定結(jié)果(西布曲明)Table 10 Precision(RSD)of sibutramine

表11 精密度測定結(jié)果(N-單去甲基西布曲明)Table 11 Precision(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表12 精密度測定結(jié)果(N,N-雙去甲基西布曲明)Table 12 Precision(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取濃度為4 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品1份連續(xù)測定6次。測得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度。由表10～表12可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明精密度均小于3%，表明儀器精密度良好。

3 結(jié)論

本試驗針對蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度等指標(biāo)。結(jié)果顯示：該方法在2～24 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；方法檢出限為西布曲明15.8 μg/kg、N,N-雙去甲基西布曲明58.6 μg/kg、N-單去甲基西布曲明18.0 μg/kg；添加濃度在4，8，16 ng/mL 3個水平條件下的平均回收率在85%～100%之間；3種化合物重復(fù)性小于5%，精密度小于3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的測定。

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