王瑾，劉新利

(齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，濟南 250353)

桑葚(Mulberry)，又作桑椹，為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥果穗。桑葚為聚花果，顏色主要有黃棕色、棕紅色至暗紫色，還有的成熟后呈乳白色。我國有15個桑種和3個變種，是世界上桑樹品種最多的國家之一。桑葚酸甜可口，味道鮮美，是人們經(jīng)常食用的水果之一。傳統(tǒng)中醫(yī)認為桑葚既能入食，也能入藥，味甘酸，性微寒。除作為滋補品外，桑葚還具有調(diào)節(jié)人體免疫力、降低人體內(nèi)血糖和血脂、抗氧化、抗衰老、保護肝臟、促進造血細胞生長等作用。主治陰血不足而致的頭暈目眩、耳鳴心悸、煩躁失眠、須發(fā)早白等癥[1]。常食桑葚能夠補益肝腎，滋陰養(yǎng)血，清肝明目，提高人體免疫力，延緩衰老。

酵素是以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[2]。在之前的文獻報道中可以看到，很多人把酵素誤以為是“酶”。然而經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酵素不等于我們傳統(tǒng)意義上所

說的 “酶”。酵素的營養(yǎng)主要來自于三個方面：首先，酵素中含有黃酮類物質(zhì)、植物色素和各種酶類等活性成分，可消除不利于健康的活性氧，幫助人體抗氧化、防衰老。其次，酵素屬于發(fā)酵產(chǎn)品，其含有的活性益生菌進入腸道后，可以迅速進行生長繁殖，起到預防感染、維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用。第三，酵素原料來源豐富，原料中含有的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等各種營養(yǎng)成分也有益于人體的健康[3]。因此，酵素是一種營養(yǎng)豐富的發(fā)酵產(chǎn)品，其內(nèi)部含有的營養(yǎng)物質(zhì)以及抗氧化成分均對人體有益，多飲酵素能夠改善人體腸道環(huán)境，延緩衰老，提高人體免疫機能。

目前，酵素研發(fā)已經(jīng)成為一股新的“市場熱”，各種酵素產(chǎn)品相應上市，國家也正在出臺一系列相應的標準以確保酵素市場的安全與穩(wěn)定。關于桑葚酵素，目前研究較多的就是關于桑葚酵素的研制工藝，如何改善其口感，而關于其生物活性方面的研究鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

桑葚酵素：市場上某公司購買的桑葚酵素。

1.1.2 試劑

沒食子酸標準品、福林酚試劑、碳酸鈉、原花青素標準品、硫酸鐵銨、甲醇、異丙醇、甲酸、正丁醇、濃鹽酸、過硫酸鉀、無水乙醇等，分析純；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)，Sigma公司；ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))，阿拉丁公司。

1.1.3 儀器

紫外可見分光光度計(UV 6100型)；高效液相色譜儀(島津LC-20AT型)。

1.2 桑葚酵素的制備

選取新鮮桑葚→打漿→添加C、N源→滅菌→接入酵母菌、乳酸菌等益生菌→發(fā)酵→檢測pH值→過濾→后熟→成分檢測→加糖調(diào)節(jié)口感。

1.3 酵素中抗氧化物質(zhì)的檢測

1.3.1 多酚含量的測定

本研究采用Folin-Ciocalteau法測定酵素中的總酚含量，配制1000 μg/mL的沒食子酸標準儲備液，再稀釋成濃度分別為10，20，30，40，50 μg/mL的沒食子酸工作液。量取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL于試管中，再分別加入5.0 mL的10%福林酚試劑，搖勻，反應3～8 min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波長下測吸光值[4]。根據(jù)結果繪制標準曲線。再將酵素溶液進行一定倍數(shù)的稀釋，量取1 mL進行測定。樣品重復測定3次。

1.3.2 原花青素含量的測定

參照GB/T 22244-2008，采用高效液相色譜法測定酵素中原花青素的含量，檢測原理是樣品中原花青素單體或聚合物在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂，然后生成深紅色的花青素離子即氰定[5]，再使用高效液相色譜進行分析，從而確定試樣中原花青素含量。

稱取原花青素標準品0.5 g溶于10 mL甲醇中，吸取該溶液0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中(最終濃度分別為0.5，1.25，2.5，5，7.5 mg/mL)，加甲醇至刻度，搖勻。各取2 mL測定。把正丁醇和濃鹽酸按照95∶5的體積比進行混合，量取15 mL置于具塞錐形瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液(2%)和2 mL試樣溶液，混合均勻，將錐形瓶放置于沸水浴中精確加熱40 min，再立即放入冰水中進行冷卻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待進行高效液相色譜分析。取2 mL樣品進行測定。高效液相色譜條件見表1。

表1 高效液相色譜條件

1.4 酵素抗氧化實驗

1.4.1 對DPPH·自由基清除作用的測定

DPPH·自由基清除能力的測定根據(jù)Wang X Z等描述的方法，先用蒸餾水將酵素樣品稀釋成不同濃度的測試液，然后配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·溶液，即準確稱取10 mg DPPH·用無水乙醇溶解到250 mL容量瓶中。取2 mL DPPH·溶液與1 mL待測液混合均勻，室溫下放置30 min，在517 nm波長下測定其吸光度，用95%的乙醇溶液做空白對照[6]。

抑制率(%)=(1—AS/A0)×100。

式中：AS為2 mL DPPH·溶液與1 mL樣品的吸光度；A0為2 mL DPPH·溶液與1 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.2 對ABTS·自由基清除作用的測定

準確稱取ABTS·3 mg，加蒸餾水0.735 mL，配制成7.4 mmol/L的ABTS·儲備液；再準確稱取K2S2O81 mg，加蒸餾水1.43 mL，配制成2.6 mmol/L K2S2O8儲備液。分別量取0.5 mL的ABTS·儲備液和K2S2O8儲備液，混合均勻，黑暗條件下室溫放置12 h。然后用95%乙醇進行稀釋，稀釋到A734 nm=0.7±0.02。取2 mL的稀釋液與0.5 mL不同濃度梯度的酵素溶液混合，室溫下放置6 min后，在734 nm下測吸光值。用95%的乙醇溶液作為空白對照[7]。抑制率的計算公式如下：

抑制率(%)=(1-AS/A0)×100。

式中：AS為2 mL ABTS·溶液與0.5 mL酵素稀釋液的吸光度；A0為2 mL ABTS·溶液與0.5 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.3 桑葚酵素中SOD活性測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定桑葚酵素中SOD的活性[8]，按照表2，在對照管與樣品管中加入相應體積的緩沖液和雙蒸水，放置到25 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min后，再加入預熱過的25 ℃鄰苯三酚(對照管中用10 mmol/L鹽酸溶液進行代替)，迅速搖勻后立即倒入10 mm比色皿中，在波長325 nm處每隔30 s測定1次吸光值A0。測定樣品中SOD活性時，在樣品管中加入0.5 mL稀釋后的樣品溶液和3.7 mL雙蒸水，其他步驟一致，得到ASOD。

表2 鄰苯三酚自氧化速率測定加樣表

抑制率(%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100%，酶活力(U/mL)=(抑制率/50%)×(V1/V2)×n。

式中：V1為反應液的總體積，mL；V2為測定樣品的體積，mL；△A0為鄰苯三酚自氧化速率；△ASOD為樣品光密度值變化速率；n為酵素稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 桑葚酵素抗氧化物質(zhì)含量檢測結果

2.1.1 多酚含量測定結果

多酚類化合物，具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[9]，是一種優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)，在醫(yī)藥和食品業(yè)具有廣泛的應用。多酚的標準曲線見圖1，線性回歸方程為：y=86.987x-1.3674(R2=0.9995)。

式中：y為沒食子酸標準品濃度(mg/L)，x為吸光度。標準曲線表明沒食子酸在濃度為10～50 mg/L區(qū)間有良好的線性關系。桑葚酵素稀釋50倍后吸光值為0.387，代入標準曲線公式得到其多酚含量為32.30 mg/L，則酵素中多酚物質(zhì)含量為1.615×103mg/L。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.1.2 原花青素含量測定結果

原花青素，簡稱OPC，一種在多種植物中都有存在的多酚類化合物，名稱來源是其在加熱的狀態(tài)下能產(chǎn)生紅色的花青素，它在醫(yī)藥、化妝品及食品行業(yè)中有廣泛的應用。實驗研究表明：原花青素的抗自由基氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍，并且能夠被人體迅速吸收，口服20 min即可達到最高血液濃度，代謝半衰期長達7 h[10]，是一種優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)。

原花青素標準品檢測見表3，標準曲線見圖2，線性回歸方程為：y=3×10-6x-0.3728(R2=0.9992)。

式中：y為原花青素濃度(g/L)，x為吸光度。標準曲線表明原花青素在濃度為0.5～7.5 mg/mL區(qū)間有良好的線性關系。

表3 原花青素標樣峰面積和濃度對比

圖2 原花青素標準曲線

桑葚酵素液相的峰面積為1905871，代入標準曲線得原花青素濃度為5.344 mg/mL。

2.2 桑葚酵素抗氧化實驗結果

2.2.1 桑葚酵素對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的自由基，其中心物質(zhì)是氮，若某物質(zhì)能夠?qū)⑵淝宄瑒t表明該物質(zhì)具有降低羥自由基、烷自由基或氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應的作用。DPPH·溶于乙醇溶液后呈現(xiàn)深紫色，它有一個孤電子，在517 nm處有強吸收峰。當有自由基清除劑時，會與之反應變成無色或淺黃色，在517 nm處吸光值也隨之降低[11]，可以用此來計算清除率，實驗結果見圖3。

圖3 桑葚酵素清除DPPH·自由基能力

由曲線可知，桑葚酵素具有較高的DPPH·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值為稀釋18.796倍，即濃度為0.0532，遠高于其他水果酵素。這可能是由于桑葚中含有抗氧化能力較高的原花青素以及多酚物質(zhì)，具有良好的DPPH·自由基清除能力。

2.2.2 桑葚酵素對ABTS·自由基的清除作用

ABTS·在氧化劑作用下能夠氧化成綠色的ABTS·，當有抗氧化物存在時，ABTS·的產(chǎn)生會得到抑制，在734 nm處有最大吸收波長，測定該波長下ABTS·相應的吸光度即可計算出樣品的總抗氧化能力[12]，實驗結果見圖4。

圖4 桑葚酵素清除ABTS·自由基能力

由圖4可知，桑葚酵素具有較高的ABTS·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值為稀釋7.456倍，即濃度為0.134。

2.2.3 桑葚酵素內(nèi)SOD測定結果

將桑葚酵素稀釋10倍后進行SOD活性檢測，經(jīng)計算，當桑葚酵素濃度為10%時，抑制率達76.23%，再根據(jù)稀釋倍數(shù)算出桑葚酵素的SOD活力為240 U/mL。這表明桑葚酵素具有較強的自由基清除能力，具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂、抗輻射和美容的功能。

3 結論

本文從桑葚酵素的抗氧化成分以及對不同自由基的清除能力方面對其進行了初步研究。研究結果表明：桑葚酵素中的多酚物質(zhì)和原花青素含量較高，對DPPH·自由基有較強的清除作用，對ABTS·自由基也有一定的清除作用，這與它較高的多酚濃度和原花青素濃度有一定的關系。這表明桑葚酵素能夠清除人體內(nèi)的自由基，減少自由基對人體造成的傷害，具有增強人體免疫力、抗氧化和抗衰老的功能。此外，桑葚酵素中也具有較高的SOD酶活性，具有很好的美容養(yǎng)顏的功效，是一種營養(yǎng)豐富的優(yōu)良保健飲品。

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