佘曼，李炳，李濤，吉順梅，鄭昌月，周曉東

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

近視是眼軸長(zhǎng)度與屈光力不匹配，導(dǎo)致物體成像于視網(wǎng)膜前的一種臨床常見(jiàn)的屈光不正，是眼科發(fā)病率最高的疾病[1]。生理狀態(tài)下，外界視覺(jué)信號(hào)到達(dá)視網(wǎng)膜光感受器后，經(jīng)過(guò)光電信號(hào)轉(zhuǎn)換，經(jīng)視神經(jīng)及視束傳遞到外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus, LGN)，再由外側(cè)膝狀體發(fā)出的纖維投射到初級(jí)視皮層(17區(qū))[2]。在這一完整視覺(jué)通路中，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都將影響最終的視覺(jué)感知[3]。其中，LGN越來(lái)越被視為處理視覺(jué)信息的“智能開(kāi)關(guān)”，是中樞負(fù)責(zé)傳遞視覺(jué)信息的重要結(jié)構(gòu)[4]。然而，目前近視發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于眼球內(nèi)的結(jié)構(gòu)，如視網(wǎng)膜、鞏膜等，很少涉及中樞外側(cè)膝狀體的研究。

形覺(jué)剝奪性近視(form deprivation myopia, FDM)和頻閃光誘導(dǎo)性近視(flickering light-induced myopia，F(xiàn)LM)是兩種不同的近視模型，研究表明神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在這兩種模型豚鼠視網(wǎng)膜的含量成相反趨勢(shì)，提示這兩種模型近視發(fā)病機(jī)制不同[5]。而多巴胺(dopamine, DA)是視網(wǎng)膜上另一重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與信號(hào)級(jí)聯(lián)控制著眼軸增長(zhǎng)，對(duì)近視發(fā)生發(fā)展有重要作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜DA在FDM及FLM兩種模型含量不同。那么，不同的外界視覺(jué)信號(hào)通過(guò)視網(wǎng)膜傳遞到中樞LGN后，神經(jīng)遞質(zhì)DA含量有何變化，在這兩種不同的近視模型上又有何差別，這正是本實(shí)驗(yàn)的研究目的?；诖吮尘?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較FLM及FDM兩種近視模型LGN的DA含量變化，旨在對(duì)比中樞DA在這兩種近視模型中的作用，初步探索近視的中樞發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)2周齡英國(guó)種短毛雄性三色豚鼠24只，屈光介質(zhì)透明，無(wú)眼部疾患或先天畸形，體重為90～110 g。來(lái)源于上海甲干生物科技有限公司【SCXK(滬)2015-0005】，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心【SYXK(滬)2015-0008】，飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫24～26℃，相對(duì)濕度55%～65%。給予豚鼠充足飼料和飲水，并定期補(bǔ)充蔬果及維生素C。實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺(jué)剝奪性近視模型的建立

24只豚鼠隨機(jī)分為3組(n=8)：①頻閃光誘導(dǎo)組(FLM組)，建模方法參照邸悅等[7]所用方法。②形覺(jué)剝奪組(FDM組)，豚鼠右眼遮蓋半透明眼罩，并確保不影響眼瞼正?；顒?dòng)，每天進(jìn)行檢查[8]。③對(duì)照組，不予特殊處理，室內(nèi)采用周期12 h的正常光照。各組實(shí)驗(yàn)周期均為8周。

1.2.2 眼球生物測(cè)量

在造模前及造模后第8周分別測(cè)量各組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度，以造模后測(cè)量值減去造模前測(cè)量值之差作為各生物參數(shù)變化值。

(1)屈光度測(cè)量方法：測(cè)量前使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，中國(guó))滴眼，每5 min一次，共滴4次，待瞳孔擴(kuò)大后進(jìn)行帶狀光檢影驗(yàn)光(KJ6B，六六視覺(jué)，蘇州)，等效球鏡記為球鏡+1/2柱鏡，重復(fù)測(cè)量3次后取平均值作為該眼屈光度[9]。

(2)眼軸長(zhǎng)度測(cè)量方法：使用Super SW1000眼科A超測(cè)量?jī)x，A超頻率為11 MHz。測(cè)量前先用鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥公司 中國(guó))表面麻醉，然后將探頭垂直對(duì)準(zhǔn)角膜中心表面，不壓迫角膜，取穩(wěn)定清晰圖像，晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線，每只眼測(cè)10次后取平均值，精確到0.01 mm。

1.2.3 高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法

將豚鼠腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(0.2 mg/mL)安樂(lè)死后，迅速斷頭取腦，于冰上取左腦外側(cè)膝狀體，然后置于凍存管內(nèi)放于液氮中，待取材完畢后精密稱(chēng)重，按1∶10體積加入勻漿液，冰上超聲勻漿。14 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10 min，取上清液裝入離心管并保存于-80℃冰箱待測(cè)。

用HPLC-ECD檢測(cè)標(biāo)本中DA濃度：每份樣本取20 μL上清液注入38℃ Acclaim C18色譜柱(2.2 μm, 2.1 mm × 100 mm；Thermo Fisher Scientific)中，然后用磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相以0.2 mL/min流速進(jìn)行分離,檢測(cè)室電壓設(shè)置+0.7 V，安全室電壓設(shè)置+0.75 V。所有數(shù)據(jù)均由ChemStation(安捷倫科技有限公司)進(jìn)行采集和分析。通過(guò)與提前設(shè)定的已知標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較得出峰值及相對(duì)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FLM及FDM模型的建立

2.1.1 造模前三組豚鼠右眼生物參數(shù)

實(shí)驗(yàn)造模前，三組豚鼠右眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度差異無(wú)顯著性(P=0.876，P=0.857)。(見(jiàn)表1)

表1 造模前3組豚鼠右眼生物參數(shù)Tab.1 Biological parameter values of the right eyes in the three groups before modeling

2.1.2 造模第8周，三組豚鼠右眼生物參數(shù)變化值

造模第8周，F(xiàn)DM組與對(duì)照組相比，右眼屈光度變化值、眼軸長(zhǎng)度變化值差異有顯著性(P<0.001，P=0.008)；FLM組與對(duì)照組相比，右眼屈光度變化值、眼軸長(zhǎng)度變化值差異有顯著性(P<0.001，P=0.026)。(見(jiàn)表2)

2.2 HPLC-ECD測(cè)量外側(cè)膝狀體中DA含量

8周造模結(jié)束后，三組豚鼠左腦外側(cè)膝狀體DA含量分別為：對(duì)照組(n=7，因外側(cè)膝狀體取材時(shí)操作失誤導(dǎo)致該數(shù)據(jù)流失)為(37.04±1.18)pg/μL；FDM組(n=8)為(24.27±3.46)pg/μL，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P=0.021)；FLM組(n=8)為(45.58±1.98)pg/μL，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P=0.01)。DA含量由高至低排列為：FLM組>對(duì)照組>FDM組。(見(jiàn)圖1)

表2 造模第8周三組豚鼠右眼生物參數(shù)變化值Tab.2 Changes of biological parameter values of the right eyes in the three groups after 8-week modeling

注：與對(duì)照組比較，**P<0.001，*P<0.05。

Note. Compared with the control group.**P<0.001 and*P<0.05.

注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖1 對(duì)各組左腦外側(cè)膝狀體多巴胺含量進(jìn)行定量分析Note. *P<0.05. All the data are expressed in (±s).Fig.1 Contents of dopamine in the left lateral geniculate nucleus of the three groups

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，頻閃光照及形覺(jué)剝奪兩種方法均能成功誘導(dǎo)出近視模型。FLM組LGN的DA含量升高，而FDM組DA含量減少，我們推測(cè)可能與這兩種近視模型的發(fā)病機(jī)制不同有關(guān)。

DA是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由腹側(cè)被蓋區(qū)和中腦黑質(zhì)致密體產(chǎn)生，再由這些區(qū)域發(fā)送擴(kuò)散至腦內(nèi)不同區(qū)域。DA纖維投射至中樞大多數(shù)結(jié)構(gòu)如基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮層、海馬、中腦和丘腦等[10]。而LGN則位于背側(cè)丘腦，負(fù)責(zé)將視網(wǎng)膜接收的視覺(jué)信息傳輸至視皮層，其細(xì)胞發(fā)育對(duì)異常視覺(jué)環(huán)境非常敏感[11]。來(lái)自視網(wǎng)膜鼻側(cè)的纖維交叉至對(duì)側(cè)，與顳側(cè)纖維共同形成視束，再通過(guò)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)的突觸傳入將視覺(jué)信號(hào)傳輸至LGN，視覺(jué)信息經(jīng)整合后再由丘腦皮層細(xì)胞發(fā)出纖維投射到初級(jí)視皮層(V1)，即構(gòu)成了RGC-丘腦皮層細(xì)胞-V1的完整視覺(jué)通路[12]。對(duì)于視覺(jué)中樞的研究，多數(shù)實(shí)驗(yàn)都以此視覺(jué)通路作為研究對(duì)象，即對(duì)一側(cè)眼進(jìn)行干預(yù)而研究對(duì)側(cè)中樞的變化[11, 13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)形覺(jué)剝奪及頻閃光誘導(dǎo)兩種方法，觀察造模后右眼的視覺(jué)變化，同時(shí)檢測(cè)左側(cè)LGN的DA含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)頻閃光誘導(dǎo)和形覺(jué)剝奪誘導(dǎo)的兩種近視，其外側(cè)膝狀體DA變化呈相反趨勢(shì)，頻閃光照組外側(cè)膝狀體DA含量增多，而形覺(jué)剝奪組則DA減少，我們認(rèn)為可能有以下幾方面原因。

一方面，F(xiàn)DM模型是通過(guò)單眼遮蓋或眼瞼縫合等方法使視網(wǎng)膜成像不清而引起近視[14]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)遮蓋豚鼠右眼，成功建立了FDM近視模型。建模過(guò)程中，由于單眼形覺(jué)剝奪可促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)末梢在外側(cè)膝狀體釋放谷氨酸鹽，提高NO濃度致使DNA斷裂，從而誘發(fā)外側(cè)膝狀體神經(jīng)元凋亡[15]。相似現(xiàn)象在兔外側(cè)膝狀體亦有報(bào)道[16]。因此我們推測(cè)FDM模型可能導(dǎo)致外側(cè)膝狀體多巴胺能神經(jīng)元凋亡增加，從而出現(xiàn)DA分泌減少的現(xiàn)象。同時(shí)，喬淑紅等[17]研究表明，與非剝奪眼相比，貓剝奪眼驅(qū)動(dòng)的外側(cè)膝狀體細(xì)胞明顯變小，視網(wǎng)膜傳入纖維與LGN神經(jīng)元突觸聯(lián)系顯著減少。那么，LGN中DA水平下降可能因?yàn)樾斡X(jué)剝奪使視覺(jué)信息傳入減少，神經(jīng)沖動(dòng)到達(dá)外側(cè)膝狀體的神經(jīng)末梢后，LGN中與其進(jìn)行突觸連接的神經(jīng)元減少，再通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元分泌的DA減少，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

另一方面，頻閃光照組LGN的DA含量較正常組增多。本次實(shí)驗(yàn)采用二周齡豚鼠，飼養(yǎng)于亮1 s，暗1 s(頻率為0.5 Hz)的特殊頻閃光環(huán)境中。在其視覺(jué)形成的敏感期內(nèi)，頻閃異常光環(huán)境可能對(duì)中樞視覺(jué)加工產(chǎn)生重要影響。研究表明，DA可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜到背外側(cè)膝狀體(dLGN)突觸傳遞的興奮性，減輕從視網(wǎng)膜到dLGN的興奮性突觸后電位(EPSC)，因此可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜信號(hào)介導(dǎo)的dLGN神經(jīng)元的激發(fā)方式[18]。而豚鼠LGN同其他哺乳動(dòng)物類(lèi)似，包含背側(cè)核和腹側(cè)核。其中背側(cè)核體積大于腹側(cè)核，且只有背側(cè)核發(fā)出的纖維投射至視皮層[19]。因此我們認(rèn)為豚鼠外側(cè)膝狀體DA水平增多的主要部位可能是背外側(cè)膝狀體，頻閃光環(huán)境導(dǎo)致的DA增加可能正是為了抑制dLGN突觸傳遞的興奮性。研究發(fā)現(xiàn)，采用微離子電滲透向貓外側(cè)膝狀體施加DA，能改變丘腦中間神經(jīng)元的視覺(jué)誘發(fā)反應(yīng)，從而影響丘腦的視覺(jué)信息加工[20]。激活LGN的D1受體可以抑制大鼠dLGN的中間神經(jīng)元活化[21]。而DA作用于LGN的D2受體則能促進(jìn)GABA能中間神經(jīng)元的活化，從而間接抑制dLGN神經(jīng)元[22-23]。向兔靜脈注射DA受體非選擇性激動(dòng)劑阿樸嗎啡可減輕dLGN對(duì)正弦光柵閃光點(diǎn)的反應(yīng)[24]。由此可見(jiàn)，DA可以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜到LGN突觸傳遞的興奮性。我們推測(cè)頻閃光信號(hào)由視網(wǎng)膜傳向LGN后，機(jī)體通過(guò)一系列調(diào)控反應(yīng)，上調(diào)LGN的DA水平，從而抗衡中間神經(jīng)元的過(guò)度興奮。

FDM是經(jīng)典且應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)性近視模型，而FLM作為較新建立的動(dòng)物模型，其發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本次實(shí)驗(yàn)提示這兩種模型的近視形成機(jī)制可能不同，從而導(dǎo)致LGN的DA水平呈相反趨勢(shì)。在某種程度上，F(xiàn)DM是視覺(jué)信息傳入減少，而FLM是閃光刺激頻率增加，兩者通過(guò)不同的作用方式，最終均形成近視。由于DA對(duì)LGN神經(jīng)元的作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，高濃度DA抑制LGN神經(jīng)元對(duì)視覺(jué)信息的反應(yīng)，而低濃度則促進(jìn)視覺(jué)反應(yīng)[22]。因此我們推測(cè)LGN的DA濃度需維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，一旦外界視覺(jué)環(huán)境打破此平衡，都將可能導(dǎo)致近視，而這也正是我們課題組的研究重點(diǎn)。此外，LGN的多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)及功能是否因此改變，初級(jí)視皮層與其又有何聯(lián)系，這是我們今后研究的另一重點(diǎn)，我們將繼續(xù)探索近視模型中DA對(duì)完整視覺(jué)通路的影響，從而為近視防治提供更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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