朱華，于品，徐艷峰，李彥紅，黃瀾，韓云林，秦川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

衰老是自然規(guī)律，目前的醫(yī)療水平無法阻止衰老進(jìn)程，但通過了解衰老機(jī)制進(jìn)而改善老化癥狀，提高老年人生活質(zhì)量卻是可行的。中國已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會，衰老進(jìn)程中機(jī)體免疫系統(tǒng)的生物學(xué)特點(diǎn)及其機(jī)制是老年病學(xué)研究的重要組成部分。60年代初，Walford教授提出了衰老免疫學(xué)理論，免疫系統(tǒng)功能隨年齡增長逐步發(fā)育、成熟。進(jìn)入老年階段，機(jī)體的免疫反應(yīng)減弱，呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)。免疫系統(tǒng)除了具有對體內(nèi)外環(huán)境的反應(yīng)和適應(yīng)能力，還在細(xì)胞與分子水平參與細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育和癌變，從根本上參與機(jī)體老化的全過程[1-2]。了解個體衰老過程中的病理生理特征，可以更好地闡述衰老與健康、疾病及長壽的關(guān)系，為研究衰老機(jī)制提供更多背景資料。本文以自然衰老的SD大鼠為研究對象，觀察免疫器官結(jié)構(gòu)和功能的變化，探討免疫系統(tǒng)在自然衰老過程中的作用，為衰老研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK-(軍)2012-0012】，4～6周齡，雌性體重130～150 g，雄性體重150～170 g。

動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所SPF隔離設(shè)施內(nèi)【SYXK(京)2010-0030】。在符合國家標(biāo)準(zhǔn)的條件下飼養(yǎng)，保證晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。待動物充分適應(yīng)環(huán)境后，在符合動物福利的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器和試劑

流式細(xì)胞儀：美國BD公司FACScan型。麻醉用戊巴比妥鈉，美國默克公司，貨號MerckP11011。免疫組化試劑：8-OHdG單抗，Abcam公司，貨號ab62623。二抗及 DAB 顯色劑為北京中杉金橋產(chǎn)品，貨號 PV-9001，ZLI-0001

1.2 方法

動物在飼養(yǎng)到6、12、18、24個月時，每組分別安樂10只動物，進(jìn)行以下指標(biāo)檢測。

1.2.1 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后股動脈放血處死，取脾細(xì)胞制作懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到2×106/mL，以ConA為刺激原體外培養(yǎng)5 d，3H-TdR摻入法檢測轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果用刺激指數(shù)SI表示。SI=12、18、24月齡組/6月齡組。

1.2.2 T細(xì)胞亞群

取0.1 mL濃度為1×107/mL的淋巴細(xì)胞懸液，分別加入各10 μL的CD3、CD4、CD8單抗，充分混勻，4℃孵育30 min，用0.2 mmol/L，pH 7.4含1% FCS的PBS洗3次，上細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。激發(fā)波長488 nm，F(xiàn)ITC檢測光譜480～630 nm，計(jì)數(shù)800個/s細(xì)胞，總數(shù)20 000個細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用LY-SIS II專業(yè)軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

使用乳酸脫氫酶釋放法，取傳代培養(yǎng)24～48 h處于對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，用0.5%臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。大鼠脾細(xì)胞單個核細(xì)胞懸液為效應(yīng)細(xì)胞，加Streptavidin標(biāo)記的辣根過氧化物酶和底物，490 nm測定吸光光度值。根據(jù)被殺傷細(xì)胞釋放的LDH量判定NK細(xì)胞殺傷力。將12、18、24月齡細(xì)胞殺傷力與6月齡比較，得出相對殺傷率。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測

動物安樂死后腹主動脈取血，離心取上清，用CBA法檢測血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-10、INF-γ和 GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的變化。

1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的檢測

樣品由北京中同藍(lán)博臨床檢測所檢測，均采用比色法。

1.2.6 組織病理學(xué)

動物安樂后取胸腺、脾，稱重后固定于4%多聚甲醛。組織經(jīng)修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，進(jìn)行HE染色和DNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG單抗的免疫組化染色，光鏡下檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫功能變化

隨年齡增長大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力降低，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)。CD4陽性T細(xì)胞數(shù)各月齡間差異無顯著性。CD8+T細(xì)胞數(shù)量隨年齡增長減少，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。脾細(xì)胞對NK靶細(xì)胞殺傷能力隨年齡增長而降低，12、18、24月齡與6月齡比較差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)(表1)。

2.2 細(xì)胞因子檢測

隨年齡增長，SD大鼠血清中IL-2含量降低，18、24月齡開始差異有顯著性(P<0.05)。IL-6、IL-10含量逐漸升高，24月齡時差異有顯著性(P<0.05)。IL-4，INF-γ，GM-CSF含量未見明顯改變(表2)。

表1 自然衰老SD大鼠免疫功能變化Tab.1 Functional changes of immune function in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

表2 自然衰老SD大鼠血清中細(xì)胞因子含量Tab.2 Serum levels of cytokines in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

2.3 SOD和MDA的變化

動物血清中SOD 含量隨年齡增長而降低，18個月開始差異有顯著性 (P<0.05)，24個月差異有極顯著性(P<0.01)。MDA含量隨年齡增長持續(xù)上升，18個月差異有顯著性(P<0.05)，24個月差異有極顯著性(P<0.01)(表3)。

2.4 組織病理學(xué)

2.4.1 臟器系數(shù)

脾的臟器系數(shù)各年齡組間差異無顯著性。隨年齡增長，動物胸腺逐漸萎縮。18、24月齡時臟器系數(shù)與6月齡比較差異有顯著性(P<0.05)。見表4。

表3 自然衰老SD大鼠血清中SOD和MDA的含量Tab.3 Serum levels of SOD and MDA in the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the young SD rats,*P<0.05，**P<0.01.

表4 自然衰老SD大鼠免疫器官臟器系數(shù)Tab.4 Immune organ coefficients of the natural aging SD rats

注：與6月齡比較，*P<0.05。

Note. Compared with the young SD rat,*P<0.05.

注：A. 12月齡大鼠胸腺輕度萎縮(HE)；B. 12月齡大鼠胸腺中度萎縮(HE)；C. 6月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC)；D. 18月齡大鼠胸腺中度萎縮(HE)，被膜脂肪生成；E. 24月齡大鼠重度萎縮(HE)，被膜脂肪生成；F. 18月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC staining)。圖1 自然衰老SD大鼠胸腺組織病理學(xué)(×100)Note. A. Mild thymic atrophy in a 12-month old rat. B. Moderate thymic atrophy in a 12-month old rat (HE staining). C. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 18-month old rat (IHC staining). D. Moderate thymic atrophy in a 18-month old rat and subcapsular fat formation (HR staining). E. Severe thymic atrophy in a 24-month old rat and subcapsular fat formation (HE staining). F. Immunohistochemical staining of 8-OHdG+ in a 18-month old rat.Fig.1 Histopathological changes of the thymus of the aging SD rats(×100)

2.4.2 胸腺組織病理學(xué)變化

動物 6月齡時胸腺被膜完整，皮質(zhì)較厚，皮質(zhì)、髓質(zhì)間界限清晰。

皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞密集排列，髓質(zhì)呈斑點(diǎn)狀散在。動物隨年齡增長，胸腺皮質(zhì)萎縮開始出現(xiàn)萎縮，12月齡2/10例輕度萎縮，18月齡3/10例輕度萎縮，2/10例中度度萎縮。24月齡3/10例輕度萎縮，4/10例中度萎縮，1/10例重度萎縮。皮質(zhì)區(qū)被膜處脂肪細(xì)胞生成，皮、髓質(zhì)比例減小。(見圖1)

2.4.3 脾的組織病理學(xué)變化

6月齡大鼠脾組織結(jié)構(gòu)清晰，紅髓、白髓及邊緣區(qū)清晰，淋巴細(xì)胞密度大。隨年齡增長，邊緣區(qū)增寬，淋巴濾泡不規(guī)則，髓外造血增多。12月齡大鼠3/10例白邊緣區(qū)輕度增寬，2/10例紅髓髓竇中度擴(kuò)張，1/10例紅髓髓竇輕度擴(kuò)張。18月齡大鼠1/10例白髓邊緣區(qū)中度增寬，2/10例紅髓髓竇中度擴(kuò)張，3/10例髓外中度造血增多。24月齡動物1/10例淋巴濾泡萎縮。1/10例白髓淋巴濾泡重度萎縮，1/10例重度髓外造血增多。(見圖2)

注：A. 6月齡大鼠脾，組織結(jié)構(gòu)清晰(HE)；B. 12月齡SD大鼠髓外造血增多(HE)；C. 12月齡大鼠8-OHdG免疫組化染色(IHC)；D. 18月齡大鼠白髓輕度萎縮，淋巴細(xì)胞減少(HE)；E. 24月齡大鼠白髓萎縮，淋巴細(xì)胞減少(H.E)；F. 紅髓區(qū)的8-OHdG+細(xì)胞(IHC)。圖2 自然衰老SD大鼠脾組織病理學(xué)(×100)Note. A. The normal spleen of a 6-month old rat (HE staining). B. Extramedullary hemopoieisis increased in the spleen of a 12-month old rat (HE staining). C. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 12-month old rat (IHC staining). D. Mild white pulp atrophy in a 18-month old rat, showing a decreased number of lymphocytes (HE staining). E. White pulp atrophy in a 24-month rat, with a decreased number of lymphocytes (HE staining). F. Immunohistochemical staining of 8-OHdG in a 12-month old rat.Fig.2 Histopathological changes of the spleen of the aging SD rats(×100)

2.4.4 免疫組化結(jié)果

8-OHdG陽性細(xì)胞呈散在或簇狀分布，著色程度由棕褐色到淺棕色，深淺不一。說明淋巴細(xì)胞的氧化程度不同，且與未氧化細(xì)胞共同存在。脾中8-OHdG陽性細(xì)胞主要成簇分布于紅髓區(qū)，白髓區(qū)較少，邊緣區(qū)幾乎無陽性細(xì)胞存在。胸腺中陽性細(xì)胞主要存在于髓質(zhì)中，從皮質(zhì)到髓質(zhì)陽性細(xì)胞逐漸增多。(見圖1，2)

3 討論

衰老的免疫學(xué)說認(rèn)為隨年齡增長機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能逐漸下降，而細(xì)胞免疫功能的衰退是重要原因。主要表現(xiàn)為對病原體識別能力下降，對外來抗原反應(yīng)性降低。T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)調(diào)控疾病及機(jī)體狀態(tài)的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究證明T淋巴細(xì)胞免疫功能失調(diào)是免疫衰老的重要特征之一[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道老年和青年免疫力間的差別主要在能激活的T細(xì)胞數(shù)量減少、功能減低。老年人體內(nèi)具有免疫功能的T細(xì)胞數(shù)量只有青年人的50%～80%，而且T細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)功能也發(fā)生變化[4-5]。衰老所導(dǎo)致的免疫力衰退使體內(nèi)細(xì)胞因子如IL-2等的含量也發(fā)生明顯變化[6]。IL-2主要由活化的CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)Th0和CTL的增殖，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子[7]。而另一些細(xì)胞因子如IL-6等產(chǎn)生增多[8]。我們的結(jié)果顯示，18月齡SD大鼠已出現(xiàn)CD4/CD8細(xì)胞比例的平衡失調(diào)(P<0.01)，具有殺傷功能的CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)，NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能力減弱(P<0.05)。脾T細(xì)胞對ConA刺激的反應(yīng)性逐漸減弱，增殖能力明顯下降(P<0.01)，誘導(dǎo)IL-2生成的能力也相應(yīng)顯著降低，血清中IL-2含量減少(P<0.05)，與報(bào)道相符。其可能的機(jī)制是老齡動物在信號傳導(dǎo)方面存在缺陷，T細(xì)胞表面絲裂原受體的表達(dá)隨年齡增長而減少，使絲裂原刺激淋巴細(xì)胞后Ca2+動員能力下降，cGMP水平降低，導(dǎo)致早期活化信號的傳導(dǎo)受到抑制，IL-2生成減少[6,9]。

現(xiàn)代免疫學(xué)理論體系中，認(rèn)為來自骨髓的前體胸腺細(xì)胞在從皮質(zhì)向髓質(zhì)遷移的過程里，通過與胸腺中撫育細(xì)胞的接觸，并受到局部細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和胸腺肽等激素的刺激，分化成熟成為具有不同功能的T淋巴細(xì)胞亞群[10-11]。機(jī)體在衰老過程中，骨髓中始祖T細(xì)胞的遷移、分化能力均下降，最終導(dǎo)致胸腺細(xì)胞數(shù)量減少，胸腺萎縮，臟器系數(shù)減小(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示，自然衰老SD大鼠胸腺的皮質(zhì)厚度逐漸變薄，說明不成熟前體T細(xì)胞隨年齡增長逐漸減少，與報(bào)道結(jié)果相符。

脾的組織學(xué)變化也反映了機(jī)體免疫功能的改變：作為機(jī)體接受抗刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所之一，青中齡SD大鼠脾小梁、被膜等結(jié)締組織較少，柔軟性較好，脾小結(jié)內(nèi)分化活躍的B細(xì)胞數(shù)量多，因而免疫應(yīng)答能力強(qiáng)。邊緣區(qū)作為脾臟-血液淋巴細(xì)胞再循環(huán)的通道，主要作用是隨時動員有免疫活性的淋巴細(xì)胞，因此青年大鼠白髓結(jié)構(gòu)清晰，邊緣區(qū)明顯，淋巴細(xì)胞密度高。老齡大鼠，由于細(xì)胞免疫功能降低，體液免疫功能代償性增強(qiáng)，導(dǎo)致脾小結(jié)中生發(fā)中心發(fā)達(dá)，白髓結(jié)構(gòu)不規(guī)則，發(fā)生偏移，淋巴細(xì)胞松散分布。髓外造血是肝、脾、淋巴結(jié)等器官在疾病或骨髓代償功能不足時恢復(fù)胚胎時期造血功能的一種病理生理現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨年齡增長可見SD大鼠脾髓外造血現(xiàn)象明顯增多，提示衰老大鼠的造血功能已出現(xiàn)障礙。免疫組化結(jié)果顯示自然衰老過程中細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷與其生存時間相關(guān)，從側(cè)面印證了DNA氧化損傷具有累積性。

綜上所述，本文通過對自然衰老SD大鼠免疫器官結(jié)構(gòu)和功能的系統(tǒng)觀察，提示免疫系統(tǒng)的增齡性退化與其氧化損傷的累積有一定關(guān)系，為衰老免疫損傷學(xué)說提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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