趙一丁，楊 潔，閆小寧，郎 娜

(1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710003； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003； 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，初發(fā)于嬰兒期，呈慢性經(jīng)過，常伴有哮喘或過敏性鼻炎，部分患者病情可以遷延至成年，嚴(yán)重影響患者及其家庭成員的生活質(zhì)量。目前AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為是在一定遺傳背景和(或)環(huán)境因素作用下，造成機(jī)體皮膚屏障功能障礙或直接引起機(jī)體的免疫反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致變應(yīng)性或非變應(yīng)性炎癥反應(yīng)。T細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子在AD炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究擬通過探討AD患者外周血T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子水平與中醫(yī)證型之間的關(guān)系，以期為AD的中醫(yī)辨證提供微觀科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷符合Hanifin與Rajka診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，中醫(yī)證型診斷符合國家中醫(yī)藥管理局四彎風(fēng)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[2]，將患者分為風(fēng)濕蘊(yùn)膚證和血虛風(fēng)燥證2型。其中風(fēng)濕蘊(yùn)膚證主癥：皮膚潮紅；瘙癢劇烈；糜爛滲出；丘疹水皰；次癥：神倦便溏；遇風(fēng)濕加重；舌淡苔薄膩；脈弦滑；血虛風(fēng)燥證主癥：皮膚干燥；肥厚或苔蘚樣變；瘙癢抓痕血痂；病程久，反復(fù)發(fā)作；次癥：食后腹脹，便秘或溏；皮膚色暗或色素沉著；舌質(zhì)淡胖；苔白脈滑；當(dāng)患者符合以上證候中主癥3項(xiàng)或3項(xiàng)以上，同時具備次癥任何2項(xiàng)或2項(xiàng)以上即可診斷為該證型。

1.1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 2歲≤年齡≤60歲，性別不限，符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，無嚴(yán)重心、腦、肝、腎等系統(tǒng)性疾病，排除妊娠及哺乳期婦女，近2周內(nèi)未接受系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑治療。

1.1.3 病例來源 表1顯示，選取2015年5月至2017年4月陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科的54例就診病理患者，其中男性30例，女性24例，年齡4～35歲，平均年齡(19.40±8.41)歲；病程4～17年，平均病程(10.01±3.69)年；辨證屬風(fēng)濕蘊(yùn)膚證者20例，血虛風(fēng)燥證者34例；招募健康志愿者20例對照組，其中男性11例，女性9例，年齡13～32歲，平均年齡(20.40±4.54)歲，2組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 一般資料特征

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 CD4/CD8/CD3檢測試劑盒、Treg檢測試劑盒，美國Beckman-Coulter公司；人白介素-4(IL-4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人白介素-12 (IL-12/P70)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人白介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；流式細(xì)胞儀，美國Beckman-Coulter公司，EPICS XL；自動板式酶標(biāo)儀，北京航宇浪琴醫(yī)療設(shè)備有限公司ZS-3；臺式離心機(jī)，濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司，TD-5 M；電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司SKP-02.600)；超低溫冰箱，日本SANYO公司MDF-192等。

1.2.2 檢測方法 分別抽取納入患者及健康志愿者空腹外周靜脈血9 ml(肝素抗凝)，分別注入3個試管中，每管3 ml。

第1管用于細(xì)胞因子IL-4、IL-12及IL-10的檢測，采用ELISA法檢測。待檢標(biāo)本離心(1200 r/min，5 min)吸取上層血清注入EP管中；加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，37 ℃反應(yīng)120 min，棄去液體甩干，不用洗滌，每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去孔內(nèi)液體甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/孔甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，37 ℃溫育60 min，棄去孔內(nèi)液體甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL /孔甩干，依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色，依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

第2管以肝素抗凝，用于CD3+、CD4+、CD8+的檢測，采用流式細(xì)胞儀。取1支流式管作為樣品測試管，將100 μL抗凝全血(EDTA)加入試管中，在管中加入10μLCD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD抗體，渦旋混勻后室溫避光孵育15 min取出試管，每管加入500 μL紅細(xì)胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻室溫避光10 min，1200 r/min離心5 min，棄去上清液每管加入2 mlPBS，渦旋混勻1200 r/min離心5 min棄去上清液，每管加入500 μLPBS混勻，4 ℃避光1 h內(nèi)上機(jī)檢驗(yàn)。

第3管用于CD4+CD25highCD127lowTreg的檢測，采用流式細(xì)胞儀。取2支流式管，編號1(同型對照管)和2(樣品測試管)分別加入50 μL EDTA，在管1中加入10μLCD4-FITC、10μLIgG1-PC5、10μLIgG1-PE抗體，渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min，在管2中加入10μLCD4-FITC、10μLCD25-PC5、5μLCD127-PE抗體，渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min取出試管，每管加入500 μL紅細(xì)胞裂解液OptiLyse C，渦旋混勻室溫避光10 min，1200rpm離心5 min，棄去上清液，每管加入2mlPBS渦旋混勻，1200rpm離心5 min，棄去上清液，每管加入500μLPBS混勻，4 ℃避光1 h內(nèi)上機(jī)檢驗(yàn)。

在淋巴細(xì)胞中以CD3設(shè)門，CD4設(shè)門，可在以CD3為橫坐標(biāo)、CD4為縱坐標(biāo)的二維散點(diǎn)圖上把淋巴細(xì)胞分為CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD4-T細(xì)胞；以CD3設(shè)門，CD8設(shè)門，可在以CD3為橫坐標(biāo)、CD8為縱坐標(biāo)的二維散點(diǎn)圖上把淋巴細(xì)胞分為CD3+CD8+T細(xì)胞和CD3+CD8-T細(xì)胞，以CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞各占CD3+T細(xì)胞的比例作為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平；以CD4設(shè)門，可在以CD4為橫坐標(biāo)、側(cè)向散射角(SSC)為縱坐標(biāo)的二維散點(diǎn)圖上把淋巴細(xì)胞分為CD4+T淋巴細(xì)胞和CD4-T淋巴細(xì)胞。在CD4+T的淋巴細(xì)胞中，以CD25、CD127設(shè)門，將CD4+CD25+細(xì)胞群平均熒光強(qiáng)度10倍的亞型細(xì)胞群定義為CD4+CD25highT細(xì)胞，獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并保存數(shù)據(jù)，分析CD4+CD25highCD127low淋巴細(xì)胞比例，將CD4+CD25highCD127low淋巴細(xì)胞作為Treg的水平。

2 結(jié)果

2.1 特應(yīng)性皮炎不同證型外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)比較

表2圖1～8顯示，風(fēng)濕蘊(yùn)膚證及血虛風(fēng)燥證AD患者外周血CD4+T細(xì)胞水平均高于對照組(P<0.05)，但兩證型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血虛風(fēng)燥證AD患者外周血CD8+T細(xì)胞水平高于風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者及對照組(P<0.05)，風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者外周血CD8+T細(xì)胞水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；風(fēng)濕蘊(yùn)膚證及血虛風(fēng)燥證AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞水平均明顯低于對照組(P<0.01)，且風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞水平低于血虛風(fēng)燥證(P<0.05)；各組AD患者外周血CD3+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群占總淋巴細(xì)胞比值比較

注：與對照組比較：※P<0.05,※※P<0.01；與風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組CD3+流式直方圖

圖2 血虛風(fēng)燥證組CD3+流式直方圖

圖3 風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組CD4+流式散點(diǎn)圖注：C2為CD4+T淋巴細(xì)胞

圖4 血虛風(fēng)燥證組CD4+流式散點(diǎn)圖注：C2為CD4+T淋巴細(xì)胞

圖5 風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組CD8+流式散點(diǎn)圖注：D2為CD8+T淋巴細(xì)胞

圖6 血虛風(fēng)燥證組CD8+流式散點(diǎn)圖注：D2為CD8+T淋巴細(xì)胞

圖7 風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組Treg流式散點(diǎn)圖 注：D門內(nèi)為CD4+CD25highCD127lowTreg

圖8 血虛風(fēng)燥證組Treg流式散點(diǎn)圖 注：D門內(nèi)為CD4+CD25highCD127lowTreg

2.2 特應(yīng)性皮炎不同證型外周血IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平比較

表2顯示，風(fēng)濕蘊(yùn)膚證及血虛風(fēng)燥證AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于對照組(P<0.05)，且風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者外周血IL-4、IL-17水平均高于血虛風(fēng)燥證(P<0.05)；風(fēng)濕蘊(yùn)膚證及血虛風(fēng)燥證AD患者外周血IL-12水平明顯低于對照組(P<0.01)，并且風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者外周血IL-12水平明顯低于血虛風(fēng)燥證(P<0.01)，血虛風(fēng)燥證AD患者外周血IL-12水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，血虛風(fēng)燥證AD患者外周血IL-10水平高于風(fēng)濕蘊(yùn)膚證患者及對照組(P<0.05)，風(fēng)濕蘊(yùn)膚證AD患者外周血IL-10水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組血清IL-4、IL-12、IL-10水平比較

注：與對照組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與風(fēng)濕蘊(yùn)膚證組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無特應(yīng)性皮炎的病名記載，根據(jù)其發(fā)病部位、臨床特征及形態(tài)，常包括在“浸淫瘡”“四彎風(fēng)”“奶癬”“胎瘡”“血風(fēng)瘡”等疾病中[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病由先天稟賦不足、胎毒遺熱、熱郁肌膚而致；或由后天飲食不節(jié)、喂養(yǎng)失當(dāng)導(dǎo)致脾失健運(yùn)，復(fù)感風(fēng)濕熱毒，邪毒蘊(yùn)結(jié)肌膚而致；反復(fù)發(fā)作、遷延日久或后天情志內(nèi)傷，可致脾虛氣血生化乏源，陰血、元?dú)夂膫麆t血虛風(fēng)燥、肌膚失養(yǎng)。1994年國家中醫(yī)藥管理局制定的《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》將本病分為風(fēng)濕蘊(yùn)膚證和血虛風(fēng)燥證兩型[2]。本研究按照此辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，通過對2種證型AD患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，探討AD中醫(yī)辨證的微觀證據(jù)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞亞群、Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失衡在AD的發(fā)病過程中有重要作用。有研究顯示，AD患者外周血CD4+和CD4+/CD8+水平增高，CD8+水平下降，導(dǎo)致體液免疫功能亢進(jìn)，細(xì)胞免疫功能低下[4]。本研究結(jié)果顯示，AD患者外周血CD4+T細(xì)胞水平均高于對照組，血虛風(fēng)燥證AD患者外周血CD8+T細(xì)胞水平高于風(fēng)濕蘊(yùn)膚型AD患者及對照組，說明AD患者體內(nèi)T細(xì)胞的輔助與抑制功能存在失衡。AD急性期主要為Th2細(xì)胞活化引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IL-4、IL-5及IL-13等，表現(xiàn)為紅斑、丘疹、水皰甚至黃水浸淫、糜爛、結(jié)痂，可伴有煩躁不安、大便干結(jié)或黏膩、小便短黃、舌紅苔黃膩、脈滑數(shù)等，證屬風(fēng)濕(熱)蘊(yùn)膚，慢性期免疫反應(yīng)則向Th1細(xì)胞占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變，IL-12及GM-CSF呈過表達(dá)[5]，表現(xiàn)為皮膚肥厚、苔蘚化、干燥、瘙癢劇烈，伴有倦怠乏力、食少腹脹、舌質(zhì)淡紅少津、苔少、脈沉弦等，證屬血虛風(fēng)燥。有研究顯示，(風(fēng))濕熱蘊(yùn)膚征象表現(xiàn)越明顯，IL-4、IL-17表達(dá)越高，而病久耗傷陰血、血虛風(fēng)燥，逐漸成為慢性期表現(xiàn)，此時相對較高的IFN-γ表達(dá)增加[6]，與本研究結(jié)果相符。

Treg細(xì)胞是新型CD4+T細(xì)胞亞群，主要通過細(xì)胞間接觸抑制和分泌抑制性細(xì)胞因子如TGF-β、IL-10而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[7]，它與Th17細(xì)胞平衡失調(diào)可引起AD皮損向急性期發(fā)展，Treg細(xì)胞可分為CD4+Treg細(xì)胞、CD8+Treg細(xì)胞、NKT Treg細(xì)胞和雙陰性Treg細(xì)胞，其中CD4+Treg細(xì)胞與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病密切相關(guān)，CD25是CD4+Treg細(xì)胞的分子標(biāo)志物，但效應(yīng)性T細(xì)胞也表達(dá)CD25，只有高表達(dá)CD25的CD4+Treg細(xì)胞才具有免疫調(diào)節(jié)作用，而CD127在CD4+Treg細(xì)胞表面特異性低表達(dá)，檢測時不用破壞細(xì)胞膜[8]，因此本研究采用CD4+CD25highCD127low作為篩選Treg細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，AD患者外周血Treg細(xì)胞低于健康對照組，說明AD患者體內(nèi)存在Treg細(xì)胞數(shù)減少導(dǎo)致免疫抑制效應(yīng)的不足[9]，且風(fēng)濕蘊(yùn)膚證患者外周血Treg水平低于血虛風(fēng)燥證患者，IL-17水平高于血虛風(fēng)燥證患者，可能說明慢性期平衡轉(zhuǎn)向Treg、Th1方向，IL-10呈高表達(dá)。在辨證論治過程可以從IL-4、IL-12、IL-17、IL-10水平的高低及CD4+、CD8+、Treg細(xì)胞的數(shù)量初步判斷患者的病情階段及中醫(yī)辨證分型，從而為遣方用藥提供依據(jù)。

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