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        外周血中Let-7e、微小RNA-206、微小RNA-605及微小RNA-1236表達(dá)與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

        2018-03-06 01:46:05李晶馬宇虹楊凌
        中國循環(huán)雜志 2018年2期
        關(guān)鍵詞:高血壓研究

        李晶,馬宇虹,楊凌

        高血壓是心血管疾病及其并發(fā)癥的主要誘因,隨著人們生活水平的提高及環(huán)境變化等因素的影響,高血壓發(fā)病率逐年上升,且呈現(xiàn)低齡化[1]。微小RNAs (miRNAs)是一類進(jìn)化上高度保守的18~25個核苷酸的單鏈小分子RNA,這類miRNA在動物中廣泛存在,主要通過與靶 mRNA 的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)互補(bǔ)配對,負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯表達(dá),參與多種生理病理過程,如細(xì)胞分化、增殖、炎癥、免疫反應(yīng)以及心血管病[2-4]。凝集素型氧化低密度脂蛋白受體(lectin-type oxidized LDL receptor 1, LOX-1)作為Let-7e的靶標(biāo)之一,在高血壓患者中會增加脂蛋白在血管中的滯留時間[5,6];miRNA-206是肌肉特異表達(dá)的小RNA,與血管壁肌肉的發(fā)育有密切的關(guān)系,研究證明miRNA-206可以作為低氧誘導(dǎo)肺動脈高血壓病發(fā)的標(biāo)志物[7,8];序列相似家族3成員A(Family with sequence similarity 3 A, FAM3A)作為miRNA-605的靶標(biāo)之一,控制著PI3K-Akt信號通路,在調(diào)控肝臟葡萄糖和脂類代謝中發(fā)揮著激活的作用[9];高血壓通常伴有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的異常表達(dá),血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)作為miRNA-1236的靶標(biāo)之一,是VEGF通路中重要的節(jié)點(diǎn),影響心血管疾病的發(fā)展[9]。因此,本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量法測定與心血管相關(guān)的Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236指標(biāo),探討原發(fā)性高血壓與miRNA表達(dá)量的關(guān)系,為原發(fā)性高血壓患者治療提供新的治療靶標(biāo)及思路。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        選擇內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管科及老年病科2014-07到2016-12收治的169例原發(fā)性高血壓患者(原發(fā)性高血壓組),其中男性81例,女性88例,平均年齡(54.24±11.26)歲;同期選取143例體檢健康者(正常對照組)作為研究對象,其中男性81例,女性62例,平均年齡(52.43±14.26)歲。高血壓的確診標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中國高血壓防治指南(2010年修訂版)[10],排除繼發(fā)性高血壓患者和免疫系統(tǒng)疾病患者。

        1.2 指標(biāo)測定的材料、試劑及儀器

        試劑:TRIzol LS Reagent(Ambion公司,美國)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo 公司,美國)、Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo公司,美國)、 RNase-free water(北京天根生化技術(shù)公司,中國)、引物由上海生工生物工程有限公司代合成、其它均為國產(chǎn)試劑。儀器:ND-1000型微量紫外分光光度計(Thermo公司,美國)、5430R低溫臺式冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司,德國)、BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京百晶生物公司,中國)、實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(Bio-rad公司,美國)、普通 PCR 儀(Applied Biosystems公司,美國)。

        1.3 研究方法

        1.3.1 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量分析

        RNA的提取按照TRIzol?LS Reagent試劑說明書進(jìn)行,所提取RNA通過微量分光光度計測定濃度。并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量,按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,使用莖環(huán)式引物作為反轉(zhuǎn)錄引物。按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix說明書進(jìn)行實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測定miRNA表達(dá)量,用通用引物U-R和miRNA特異引物分別作為上下游引物,引物退火溫度均為60℃,其他參照說明書,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)表達(dá)量分析。

        1.3.2 引物

        以U6作為管家基因,miRbase中提供的miRNA成熟序列設(shè)計莖環(huán)式反轉(zhuǎn)錄引物和實(shí)時定量擴(kuò)增引物。引物序列如表1。

        表1 引物序列

        1.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

        用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。選用分析方法有單因素方差分析(ANOVA LSD),雙變量相關(guān)分析及多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組患者臨床基本情況(表2)

        表2 兩組患者臨床基本情況及相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果

        表2 兩組患者臨床基本情況及相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果

        注: miRNA:微小RNA。1 mmHg=0.133 kPa

        結(jié)果顯示,年齡、性別和體重指數(shù),在原發(fā)性高血壓組和正常對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而原發(fā)性高血壓組的收縮壓和舒張壓均高于正常對照組(P均<0.05)。

        2.2 miRNA表達(dá)方面(表2)

        原發(fā)性高血壓組中Let-7e、miRNA-605的表達(dá)量均高于正常對照組(P<0.05);而原發(fā)性高血壓組中miRNA-206、miRNA-1236的表達(dá)量均低于正常對照組(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2.3 相關(guān)性分析(表3)

        結(jié)果可見,Let-7e的表達(dá)量與收縮壓呈顯著正相關(guān)(r=0.562,P<0.05);miRNA-206表達(dá)量與收縮壓呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.582,P<0.05),與舒張壓呈顯著正相關(guān)(r=0.507,P<0.05);miRNA-605的表達(dá)量與收縮壓呈顯著正相關(guān)(r=0.625,P<0.05);miRNA-1236的表達(dá)量與舒張壓呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.598,P<0.05),與體重指數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.690,P<0.05)。

        2.4 多因素Logistic回歸分析(表4)

        結(jié)果顯示,年齡和性別不是原發(fā)性高血壓的的危險因素(P=0.9842),體重指數(shù)的升高,顯著增加患原發(fā)性高血壓的危險(P<0.01),Let-7e和miRNA-605的表達(dá)量的升高,顯著增加患原發(fā)性高血壓的危險(P<0.05和P<0.01),而miRNA-206和miRNA-1236的表達(dá)量的降低,也顯著增加原發(fā)性高血壓患病的風(fēng)險(P<0.01和P<0.01)。

        表3 miRNAs表達(dá)量與原發(fā)性高血壓相關(guān)性分析

        表4 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

        3 討論

        高血壓患病率逐年升高[10],在我國有70%的腦卒中和50%的心肌梗死與高血壓有關(guān)[11],高血壓已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓的發(fā)病是與多種因素有關(guān)[12]。miRNA 是一類由18~25 nt核苷酸組成的非編碼單鏈保守的小分子RNA,其表達(dá)具有組織特異性等特點(diǎn),在細(xì)胞分化,生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用[13]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)miRNA與高血壓的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[14],目前主要發(fā)現(xiàn),miR-9、miR-21、miR-18b等可能參與高血壓的發(fā)病機(jī)制[15-18]。研究發(fā) 現(xiàn),Let-7e[14]、miRNA-206[19]、miRNA-605[20]及miRNA-1236[21]可能通過抑制平滑肌增殖,促進(jìn)血管再生,抗動脈粥樣硬化,抗血栓等作用參與原發(fā)性高血壓的發(fā)病,但是其結(jié)果仍然存在一定爭議,還有待深入研究。

        Let-7e被發(fā)現(xiàn)與小鼠的心臟發(fā)育有關(guān),其靶標(biāo)叉頭框蛋白1(FOXP1)、T盒轉(zhuǎn)錄因子5(TBX5)、心臟和神經(jīng)嵴衍生物表達(dá)蛋白1(HAND1)、蛋白激酶2(AKT2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活1A(PPARGC1A)等也參與血管的形成[22];miRNA-206及其靶標(biāo)神經(jīng)源同源蛋白3(Notch3)、低氧誘導(dǎo)因子1 (HIF-1a)被發(fā)現(xiàn)參與平滑肌細(xì)胞增殖與分化[23,24];miRNA-605及其靶標(biāo)蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)、SERTA 結(jié)構(gòu)域蛋白 4(SERTAD4)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥核因子(NPAT)、FAM3A等參與P53通路,與癌癥及細(xì)胞凋亡有關(guān)[25];miRNA-1236及其靶標(biāo)VEGFR、含7螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白(CCDC7)、RAS通路相關(guān)蛋白13(RAB13)、細(xì)胞色素P450 4V2(CYP4V2)等與VEGF通路有關(guān)[26]。本研究通過對Let-7e,miRNA-206,miRNA-605及miRNA-1236及其生物學(xué)功能進(jìn)一步鑒定,確認(rèn)Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236與原發(fā)性高血壓的發(fā)病具有相關(guān)性。

        尿液、外周血等體液中含有循環(huán)miRNA,其可以作為診治疾病的臨床標(biāo)志物[27,28]。由于循環(huán) miRNA具有易獲取、易研究的特點(diǎn),逐漸成為疾病標(biāo)志物研究及發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn),具有一定臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)Let-7e、miRNA-206、miRNA-605 及miRNA-1236可以作為原發(fā)性高血壓診斷的候選標(biāo)志物,盡管臨床的應(yīng)用還需要更多的樣本做驗(yàn)證,而且相比于目前的診斷技術(shù),盡管不是非常方便,但是或許可以用于特殊類型高血壓或者繼發(fā)性高血壓的區(qū)別和鑒定。另外Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236可以作為原發(fā)性高血壓治療的候選靶點(diǎn),通過抑制或增強(qiáng)內(nèi)源miRNA及相關(guān)基因的表達(dá),或者補(bǔ)充外源的miRNA,使其miRNA的表達(dá)向期望的方向發(fā)展,進(jìn)而有助于原發(fā)性高血壓疾病的治療。

        高血壓已經(jīng)嚴(yán)重危害人類健康的疾病,盡管目前的防控措施已經(jīng)取得顯著效果,但很難治愈。本研究初步證明Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236的表達(dá)量與原發(fā)性高血壓的發(fā)病有很大的關(guān)系,其具體調(diào)控機(jī)制還有待后續(xù)細(xì)胞以及動物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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