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(新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011)

鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是一類環(huán)境雌激素物質(zhì)，主要作為塑料的增塑劑使用，同時被廣泛應(yīng)用于建筑材料、化妝品、合成橡膠、洗滌劑、潤滑油和醫(yī)藥產(chǎn)品等各行業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中[1]。鄰苯二甲酸酯類化合物屬于高污染的一類環(huán)境激素污染物，具有不同程度的毒性，在人體內(nèi)累積可導(dǎo)致生殖毒性、畸形、免疫毒性和神經(jīng)毒性等嚴(yán)重危害[2-3]。目前有關(guān) PAEs的研究多集中于環(huán)境樣品和塑料制品等方面[4-7]，隨著人們對食品質(zhì)量安全的關(guān)注，學(xué)者將PAEs的殘留研究方向擴(kuò)展到食品領(lǐng)域，其檢測方法主要為色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[8-11]。

水產(chǎn)品作為人類食物的重要來源之一，其安全與人體健康緊密聯(lián)系。本次實(shí)驗(yàn)選擇的研究對象為河蚌。河蚌屬雙殼類軟體動物，主要分布于長江中下游地區(qū)的淡水湖泊中，為中國特有資源[12]。已有相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道我國長江與黃河兩大水域均存在較嚴(yán)重的PAEs污染，且該類化合物極易溶出并釋放進(jìn)入環(huán)境體系，造成水質(zhì)污染并通過富集進(jìn)入水生生物體。由于河蚌的生長周期較長，主要生活在水體環(huán)境的底部，可通過吸收富集水體環(huán)境中的PAEs而存在健康風(fēng)險(xiǎn)，因此河蚌蚌肉中PAEs殘留量的監(jiān)測工作逐漸引起研究人員的重視。

對水產(chǎn)品可食部位污染物的殘留檢測工作，前處理是整個實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵部分，由于待測水產(chǎn)樣品可食部位油脂含量高，基質(zhì)較為復(fù)雜，需要在前處理過程中應(yīng)用固相萃取柱對色素、油脂和水分等進(jìn)行凈化去除。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件，建立同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定河蚌樣品中7種PAEs的方法。采用同位素稀釋[16-18]的方法能夠很好地降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的干擾，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度，在微量組分準(zhǔn)確定量分析方面有很大優(yōu)勢，符合殘留物的檢測分析和監(jiān)控要求。可為PAEs在水體環(huán)境和水產(chǎn)品中的來源、分布及遷移過程的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為食品安全與人體健康風(fēng)險(xiǎn)潛在危害的暴露水平研究提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜儀(配電子轟擊離子源，美國Thermo公司)；分析天平(Mettle-Toledo 梅特勒-托利多)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA埃朗)；乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱(500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)；均質(zhì)機(jī)(T18 digital，德國IKA公司)；離心機(jī)(CT18RT，上海天美公司)；冷凍干燥機(jī)(ZL-12TD ，上海左樂儀器有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)品：PAEs[鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)；D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP為內(nèi)標(biāo)物]化合物標(biāo)準(zhǔn)品(購自德國De.Ehrenstorfer公司)。

試驗(yàn)樣品：人工養(yǎng)殖河蚌。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量7種PAEs標(biāo)準(zhǔn)品置于20.00 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配置成濃度為20.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置4℃冰箱中避光保存。將7種PAEs的單標(biāo)混合并用正己烷稀釋至濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(分別加入D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP，三種內(nèi)標(biāo)濃度均為0.50 mg/L)待用。

1.3 樣品采集與前處理

通過底網(wǎng)捕撈對河蚌進(jìn)行樣品采集，采集后放置于帶有冰袋的保溫箱中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，去殼取出可食用部分，用組織搗碎機(jī)將樣品勻漿處理后，迅速冷凍24 h，放入凍干機(jī)內(nèi)-40℃進(jìn)行冷凍干燥去除水分，備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

試驗(yàn)過程中為避免塑料制品中的鄰苯二甲酸酯對測試的干擾，均替換使用玻璃器皿，且經(jīng)過色譜級的甲醇和正己烷浸泡潤洗，馬弗爐內(nèi)高溫烘干。

準(zhǔn)確稱取0.50 g樣品于50.00 mL玻璃管中，加入15.00 mL乙酸乙酯溶劑，渦旋振蕩3 min，低溫條件超聲萃取15 min，高速離心1 min，取上清液至濃縮瓶中，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2.00 mL，轉(zhuǎn)移至Florisil柱凈化，用10.00 mL正己烷：丙酮(92∶8)混合溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液濃縮后用正己烷定容至2.00 mL，裝進(jìn)樣瓶待測。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

離子源：電子轟擊(EI)源，70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：270℃；色譜柱：HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.50 μm)；程序升溫：80℃，以20℃/min升溫至280℃，保持15 min；載氣：氦氣(99.999%)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃；進(jìn)樣量：2.0 μL，不分流進(jìn)樣；溶劑延遲：4.0 min；掃描模式和范圍：全離子掃描(Full scan)，50～450 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 同位素內(nèi)標(biāo)物的選擇

同位素內(nèi)標(biāo)物必須要與待測化合物有相似的結(jié)構(gòu)，在樣品前處理過程及儀器響應(yīng)上具有相同的性質(zhì)，本試驗(yàn)選用D4-DEP、D4-DIBP、D4-DEHP三種同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量，通過色譜峰保留時間及選擇離子豐度比為目標(biāo)化合物定性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測定分析。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

質(zhì)譜的定性和定量是以離子碎片為選擇依據(jù)的，根據(jù)PAEs化合物在EI模式下電離裂解的結(jié)果，選定檢測靈敏度較高且豐度較強(qiáng)的碎片離子作為定性離子，選擇基質(zhì)干擾小的特征離子作為定性離子，質(zhì)譜參數(shù)見表1。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令[19]規(guī)定，對于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個確證點(diǎn)的要求，PAEs化合物標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)物的色譜圖及定量離子流圖見圖1。

表1 鄰苯二甲酸酯類的質(zhì)譜參數(shù)

注：*為定量離子。

Note：The asterisk represented the quantitation ion.

注：特征峰(Peak identifications)1：DMP；2：DEP；3：DIBP；4：DBP；5：BBP；6：DEHP；7：DNOP；8：D4-DEP；9：D4-DIBP；10：D4-DEHP。

2.3 提取溶劑的選擇

樣品中PAEs殘留量檢測前處理常用的萃取溶劑主要有：二氯甲烷、乙腈、正己烷、乙酸乙酯。本實(shí)驗(yàn)通過對比以上四種溶劑的萃取效率，參考組分的回收率和以色譜圖中基質(zhì)干擾峰為依據(jù)，結(jié)果表明PAEs各個組分的萃取效率較為接近(圖2)，其中正己烷和乙酸乙酯的效果略高，由于乙腈極性較強(qiáng)，在萃取目標(biāo)物的同時也會溶解部分基質(zhì)，對色譜峰具有一定的干擾，而二氯甲烷的毒性較強(qiáng)，目前已逐漸被相似溶劑替代，本實(shí)驗(yàn)綜合考慮后選擇乙酸乙酯作為樣品的萃取溶劑。

2.4 固相萃取柱的選擇

河蚌蚌肉的基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)，極易溶解在萃取溶劑中，從而干擾待測化合物的色譜分析，需要對雜質(zhì)進(jìn)行凈化處理，目前以吸附為主要目的的固相萃取(SPE)柱有N-丙基乙二胺(PSA)、C18、弗羅里硅土(Florisil)、中性氧化鋁(Al2O3-N)4種。其中PSA可去除樣品基質(zhì)中的極性色素、糖類和脂肪酸等化合物；C18萃取柱作為反相吸附劑，能夠吸附樣品基質(zhì)中的脂肪、脂質(zhì)、甾醇等化合物；Florisil萃取柱是一種鍵合鎂吸附劑，能除去極性干擾物；Al2O3-N可吸附保留芳香族和脂肪胺類等含電負(fù)性基團(tuán)的化合物。本實(shí)驗(yàn)對比以上4種SPE柱對河蚌蚌肉樣品的凈化效果(圖3)，通過Florisil柱凈化后的樣品雜質(zhì)峰較少，且回收率符合殘留分析的要求。

2.5 方法線性

在上述儀器條件下，對梯度濃度(0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，每種濃度進(jìn)樣3次。在該范圍內(nèi)以質(zhì)量濃度與峰面積比(待測組分與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比)作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性方程，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99，表明該方法具有良好的線性關(guān)系。

2.6 回收率、檢出限及精密度

對河蚌蚌肉樣品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，分別進(jìn)行3個水平(0.50、1.00、2.00 mg/kg)的添加回收試驗(yàn)，每個添加濃度進(jìn)行3個平行試驗(yàn)。通過測定計(jì)算得出不同濃度的平均回收率在73.1%～94.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9.3%，該方法精密度良好。以3倍和10倍信噪比(S/N)作檢出限(LODs)和定量限(LOQs)，結(jié)果表明本方法具有較高的靈敏度(表2)。

表2 河蚌樣品中鄰苯二甲酸酯平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.7 樣品測定

通過本試驗(yàn)優(yōu)化的前處理及儀器條件對河蚌進(jìn)行PAEs含量測定，同時測定乙酸乙酯和正己烷試劑中PAEs的殘留量，檢測后發(fā)現(xiàn)正己烷試劑中有少量的PAEs檢出，考慮原因是封裝溶劑的塑料瓶蓋少量溶解到溶劑中，在扣除溶劑本底后，測定的河蚌樣品中僅有DEP和DBP兩種目標(biāo)物殘留，殘留量在10～30 μg/kg范圍內(nèi)，通過對養(yǎng)殖區(qū)域環(huán)境水樣中PAEs的調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水體中存在DEP殘留，由此可見河蚌蚌肉中PAEs殘留的主要途徑是通過水體遷移和富集。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件對河蚌蚌肉中PAEs進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明7種PAEs在0.10～2.00 mg/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，添加回收率試驗(yàn)結(jié)果均高于70%以上，符合殘留量檢測的要求，可較準(zhǔn)確地反映所測樣品的含量，可適用于大批量樣品的監(jiān)測工作。由于河蚌的生長環(huán)境在湖底，因此后期將進(jìn)一步對湖區(qū)的底泥中PAEs污染狀況進(jìn)行監(jiān)測，從而對污染物在整個環(huán)境中的遷移規(guī)律進(jìn)行研究。

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