(1.莆田市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351100； 2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

雙線紫蛤(Soletellinadiphos)隸屬于簾蛤目(Veneroida)、櫻蛤總科(Tellinoidea)、紫云蛤科(Psammobiidae)、紫蛤?qū)?Soletellina)，其斧足肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，經(jīng)濟價值高，是一種名貴的底棲雙殼類，也是福建省省級重點保護(hù)水生野生動物之一，由于海域環(huán)境驟變和人為因素破壞，曾經(jīng)廣泛分布在莆田市南日島周邊海域的雙線紫蛤自然野生種群資源，目前已銳減。國內(nèi)外對雙線紫蛤的研究尚不充分，文獻(xiàn)檢索集中在人工繁育[1-2]、性狀差異[3]、血細(xì)胞分類[4]、毒素[5-8]及重金屬[9]毒理、生化成分[10]和機體代謝[11-12]等領(lǐng)域，極少涉及分子遺傳[13]方向。紫蛤?qū)俚姆N間形態(tài)較為相似，部分學(xué)名、俗名和同種異名的處理使用及其對應(yīng)的翻譯仍未很好的統(tǒng)一，例如雙線紫蛤(中國)的命名，也有學(xué)者報道采用雙線血蛤、雙線血蚶、雙線紫云蛤、西施舌(臺灣地區(qū))、雙線西施舌、西刀舌、西肚舌、紫晃肉、紫蛤、紫貝、富士紫貝、Hiatuladiphos(中國、菲律賓、荷蘭)、Psammotaeadiphos、Sanguinolariaacuminata(日本)、Sanguinolariadiphos(中國)、Solendiphos、Solenviolaceus、Soletellinaacuminata、Soletellinaadamsii(日本)、Soletellinacumingiana、Soletellinadiphos(中國、印度)、Soletellinaradiata等，同種的眾多異名可能存在“異種”，僅憑記錄提及，缺乏確實存在的標(biāo)本證據(jù)、細(xì)節(jié)圖片或分子生態(tài)數(shù)據(jù)，難以進(jìn)一步采樣比對區(qū)分，致使對現(xiàn)有的野生種質(zhì)資源鑒定、多樣性分析等研究進(jìn)度遲緩。

南日島位于莆田市興化灣口外，地處東經(jīng)119°26′～119°34′、北緯25°09′～25°15′，是福建省第三大海島，灘涂和海域廣闊，海洋生物資源豐富，為農(nóng)業(yè)部審查通過的珍稀瀕危水生動物——雙線紫蛤增殖放流苗種供應(yīng)單位基地，為順利開展本地區(qū)雙線紫蛤的原種保護(hù)、自然資源恢復(fù)、規(guī)模化人工繁育、遺傳改良和可持續(xù)開發(fā)利用提供了有力保障。

為調(diào)研南日島雙線紫蛤自然種群的種質(zhì)情況，本研究通過測錄養(yǎng)殖和野生群體不同生長時期4個貝殼形態(tài)性狀，克隆野生個體8條序列并與紫云蛤科或櫻蛤總科內(nèi)部分相關(guān)序列比較同源性和進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)行野生群體不同組織6種同工酶電泳，以分析表達(dá)活性及組織特異性，以期為今后南日島雙線紫蛤資源的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析、保護(hù)區(qū)規(guī)劃、企業(yè)和地方標(biāo)準(zhǔn)制定等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用雙線紫蛤樣本由福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司于2011年4月至2016年9月分批贊助提供，野生樣本隨機采捕于海區(qū)潮間帶，養(yǎng)殖樣本采集自該企業(yè)育苗養(yǎng)殖池。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)測定

雙線紫蛤樣本洗凈黏附物后，輪番輕甩數(shù)下，置于白瓷盤內(nèi)用濾紙盡量拭干殼表與外露鮮體部的殘留水漬，使用游標(biāo)卡尺和電子天平測定殼長(L)、殼高(H)、殼寬(B)和個體鮮重(W)等性狀指標(biāo)。用Excel軟件處理所測量樣本各形態(tài)參數(shù)，計算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差并導(dǎo)出參數(shù)間的關(guān)系式。

1.2.2 序列擴增

雙線紫蛤樣本解剖取閉殼肌，DNA提取采用TIANGEN海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ABI Veriti PCR儀擴增12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS和28S rRNA序列，產(chǎn)物回收送樣[14]。測序結(jié)果提交GenBank，核酸序列同源性采用NCBI blastn在線程序比對，Clustal X package對位，MEGA 4.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Kimura 2-parameter計算遺傳距離(bootstrap值重復(fù)1 000次)。

表1 用于南日島雙線紫蛤序列的部分有效擴增引物

續(xù)表1

1.2.3 同工酶電泳

解剖雙線紫蛤樣本，分別稱取0.5 g閉殼肌、0.5 g斧足肌，各加入3倍體積4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)冰浴勻漿，4℃抽提1.0 h，4℃離心(14 000 r/min，15 min)至上清液澄清，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳對同工酶酯酶(EST)、蘋果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)進(jìn)行分析，分離膠(pH 8.8，8.2%)和濃縮膠(pH 6.8，3.6%)制膠凝固2 h，1×Tris-Gly電泳緩沖液，上清液10 μL與等體積甘油加樣緩沖液混勻上樣，4℃電泳(90 V，40 mA，4～8 h)[14]，電泳結(jié)束浸入染液[15]染色，沖洗、脫色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)測定

南日島雙線紫蛤群體測量的樣本總數(shù)為67枚，含養(yǎng)殖1齡貝20枚、野生2～3齡貝47枚，另觀察人工育苗的2～3月齡幼貝若干(圖1)。經(jīng)測量計算，所采樣本1齡貝的殼長為3.90～5.50 cm，平均(4.61±0.45)cm；殼高為1.80～2.70 cm，平均(2.24±0.23)cm；體重為3.50～10.50 g，平均(6.32±1.79)g；殼長為殼高的1.91～2.19倍，平均(2.06±0.08)倍；殼長為體重的0.52～1.14倍，平均(0.77±0.16)倍；殼高為體重的0.26～0.54倍，平均(0.37±0.07)倍。2～3齡貝的殼長為8.16～11.59 cm，平均(9.51±0.73)cm；殼高為3.96～5.60 cm，平均(4.60±0.36)cm；殼寬為2.01～2.36 cm，平均(2.22±0.10)cm；體重為35.70～112.20 g，平均(57.88±15.87)g；殼長為殼高的1.88～2.21倍，平均(2.07±0.08)倍；殼長為殼寬的3.85～4.68倍，平均(4.20±0.19)倍；殼高為殼寬的1.79～2.20倍，平均(2.03±0.09)倍；殼長為體重的0.10～0.24倍，平均(0.17±0.03)倍；殼高為體重的0.05～0.11倍，平均(0.08±0.01)倍；殼寬為體重的0.03～0.05倍，平均(0.04±0.00)倍。樣本殼長、殼高關(guān)系式為線性H=0.478 7L+0.042 5(R2=0.983 1)，殼長、體重關(guān)系式為乘冪W=0.059 1L3.045 9(R2=0.990 2)，殼高、體重關(guān)系式為乘冪W=0.529 5H3.058 2(R2=0.993 2)，關(guān)系式R2值越高表示樣本個體間蛤殼形態(tài)的兩兩性狀之間的相關(guān)性越高。

注：A：2～3月齡貝；B：1齡貝；C：2～3齡貝。

Notes：A was 2～3 months old shellfish，B was 1 year old shellfish，C was 2～3 years old shellfish.

2.2 序列擴增

南日島雙線紫蛤野生個體的12S rRNA(KU521370)分子量436 bp，與數(shù)據(jù)庫中同源序列JN398363(439 bp)相似性為91.8%，種內(nèi)距離為0.076 0，其中保守位點404個，變異位點31個、占7.0%，沒有簡約信息位點、自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為31.3%、28.7%、16.8%、23.2%、60.0%，A+T含量高于G+C，沒有插入位點，缺失位點5個，轉(zhuǎn)換突變的核苷酸位點19個，顛換突變的核苷酸位點12個，轉(zhuǎn)換顛換比為1.58。櫻蛤總科(Tellinoidea)12S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹中雙線紫蛤KU521370(福建莆田)與JN398363(廣西北海)聚支、節(jié)點支持率為100%，二者與同屬紫云蛤科(Psammobiidae)血蛤?qū)?Nuttallia)的紫彩血蛤(N.olivacea)種間距離為0.300 7；同櫻蛤科(Tellinidae)白櫻蛤?qū)?Limecola)的波羅的海白櫻蛤(L.balthica)、明櫻蛤?qū)?Moerella)的彩虹明櫻蛤(M.iridescens)遺傳距離分別為0.172 9、0.185 4，與雙帶蛤科(Semelidae)雙帶蛤?qū)?Semele)的粗雙帶蛤(S.scabra)種間距離為0.335 8，與截蟶科(Solecurtidae)截蟶屬(Solecurtus)的總角截蟶(S.divaricatus)、縊蟶屬(Sinonovacula)的縊蟶(S.constricta)種間距離分別為0.195 5、0.357 8(圖2)。

16S rRNA(KM411962)分子量516 bp，與同源序列JN398363(474 bp)相似性為88.7%，種內(nèi)距離為0.121 9，保守位點423個，變異位點49個、10.3%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.7%、31.1%、14.5%、27.7%、57.8%，A+T含量稍高于G+C，沒有插入位點，缺失位點5個，轉(zhuǎn)換突變位點30個，顛換突變位點19個，轉(zhuǎn)換顛換比為1.58；與疑似同種異名的亞當(dāng)斯紫蛤(S.adamsii)(日本宮崎市)序列AB751315(475 bp)相似性為99.8%，遺傳距離為0.002 2，保守位點474個，變異位點1個、占0.2%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為26.9%、30.2%、15.1%、27.8%、57.1%，A+T含量高于G+C，沒有插入及缺失位點，轉(zhuǎn)換突變位點1個。紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹中雙線紫蛤KM411962與JN398363沒有優(yōu)先聚支，而是與亞當(dāng)斯紫蛤聚集、節(jié)點支持率達(dá)100%，后與中國紫蛤(S.chinensis)群體、JN398363、綠紫蛤(S.virescens)群體聯(lián)合成一個紫蛤?qū)俅厝海细驅(qū)俚逆⒚么厝河杀緦俚募庾细?S.acuta)、紫云蛤?qū)?Psammotaea)的小紫蛤(P.minor)和長型紫云蛤(P.elongata)群體組成；其并簇為蒴蛤?qū)?Asaphis)的紅樹蒴蛤(A.deflorata)、對生蒴蛤(A.violascens)和地蛤?qū)?Gari)的斑紋地蛤(G.maculosa)、射線斜紋紫云蛤(G.pallida)、G.pusilla，外支為紫蛤?qū)俚腟.petalina、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤(S.tchangsii)；血蛤?qū)俚娜毡狙?N.japonica)、紫彩血蛤群體形成了紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)樹的外群。南日島雙線紫蛤樣本與亞當(dāng)斯紫蛤遺傳距離最近，小于雙線紫蛤不同地理個體間的距離0.121 9；與中國紫蛤群體的平均距離為0.090 2、小于種內(nèi)距離，同綠紫蛤群體距離為0.163 7、稍大于種內(nèi)距離，與尖紫蛤距離為0.190 0，與S.petalina距離為0.232 7、為屬內(nèi)最大；而雙線紫蛤JN398363與中國紫蛤距離最近，為0.103 9，其次為亞當(dāng)斯紫蛤的0.119 2、綠紫蛤的0.143 9(圖3)。

COI(KU605621)分子量1 760 bp，KU605621與2條種內(nèi)同源序列JN859948(654 bp)、JN398363(654 bp)相似性分別為100.0%、83.2%，種內(nèi)距離分別為0.000 0、0.193 0，其中保守位點654個、544個，變異位點0個、110個，各分別占比0.0%、16.8%，沒有簡約信息位點，自裔位點110個，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為19.0%、41.8%、15.6%、23.6%、60.8%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，Pos #1堿基G的含量最高(32.1%)，堿基T的含量依次為Pos #3(52.3%)>Pos #2(45.0%)>Pos #1(28.1%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為19.3%、52.3%、5.2%、23.2%，沒有插入和缺失位點，轉(zhuǎn)換位點67個，顛換位點43個，轉(zhuǎn)換顛換比1.56。紫云蛤科COI系統(tǒng)樹主要為兩個大分支，雙線紫蛤KU605621與同種的JN859948聚集、支持率為100%，卻與JN398363沒有聚支，分支也不同。系統(tǒng)樹一大分支為紫蛤?qū)?，由中國紫蛤、雙線紫蛤KU605621和JN859948、綠紫蛤群體組成，其中雙線紫蛤KU605621和JN859948與中國紫蛤、綠紫蛤種間遺傳距離分別為0.168 4、0.186 2，小于與JN398363的種內(nèi)距離0.193 0；另一大分支則由紫云蛤?qū)俚拈L型紫云蛤、Sanguinolaria屬的張氏紫蛤群體和蒴蛤?qū)俚募t樹蒴蛤、紫蛤?qū)俚碾p線紫蛤JN398363構(gòu)成，雙線紫蛤JN398363與紅樹蒴蛤遺傳距離最小、為0.165 8，其次是中國紫蛤的0.175 0、長型紫云蛤的0.191 2，與綠紫蛤和張氏紫蛤平均距離分別為0.196 7和0.231 2；兩大分支的外支為地蛤?qū)俚陌呒y地蛤，血蛤?qū)俚淖喜恃蛉后w形成系統(tǒng)樹的外群(圖4)。

Cytb(KU568465)分子量1 216 bp，KU568465與同源序列JN398363(1 076 bp)相似性為84.4%，種內(nèi)距離為0.177 1，保守位點908個，變異位點168個、占15.6%，沒有簡約信息位點及自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為23.0%、40.3%、15.4%、21.3%、63.3%，A+T含量高于G+C，編碼氨基酸的3個密碼子Pos #1、Pos #2和Pos #3中，堿基T的含量均為最高，依次Pos #3(49.7%)>Pos #2(40.6%)>Pos #1(30.6%)，Pos #3中A、T、C、G的比例分別為21.8%、49.7%、9.5%、19.0%，沒有插入和缺失位點，轉(zhuǎn)換突變位點100個，顛換突變位點68個，轉(zhuǎn)換顛換比1.47。櫻蛤總科Cytb系統(tǒng)樹中雙線紫蛤KU568465與JN398363聚集、支持率為99%，再與截蟶科的總角截蟶相聚、支持率為95%，種間距離為0.219 3，后與波羅的海白櫻蛤群體和彩虹明櫻蛤組成的小支集合，外支為粗雙帶蛤和紫彩血蛤，縊蟶為外群(圖5)。

H3(KU605616-20)分子量374 bp，KU605616-20數(shù)據(jù)庫暫未檢索到種內(nèi)同源序列。櫻蛤總科H3系統(tǒng)樹中雙線紫蛤KU605616-20聚集、支持率為86%，與同科的紅樹蒴蛤、斑紋地蛤形成系統(tǒng)樹的外群，種間距離分別為0.061 4、0.055 7；斧蛤科(Donacidae)斧蛤?qū)?Donax)的截形斧蛤(D.trunculus)、長條斧蛤(D.variegatus)、D.veruinus、三角斧蛤(D.deltoides)組成系統(tǒng)樹的一個獨立小支，系統(tǒng)樹的大支為混合簇，由雙帶蛤科團結(jié)蛤?qū)?Abra)的A.prismatica、白色唱片蛤(A.alba)和光澤唱片蛤(A.nitida)、長舌蛤科(Scrobiculariidae)長舌蛤?qū)?Scrobicularia)的淺溝長舌蛤(S.plana)、截蟶科Tagelus屬的美國截蟶(T.plebeius)、櫻蛤科Ameritella屬的多彩櫻蛤(A.versicolor)、Scissula屬的素櫻蛤(S.similis)、白櫻蛤?qū)俚牟_的海白櫻蛤聚成(圖6)。

18S rRNA(KX185515)分子量1 788 bp，KX185515暫未有種內(nèi)同源序列。紫云蛤科18S rRNA系統(tǒng)樹中雙線紫蛤KX185515與地蛤?qū)俚闹行偷馗?G.intermedia)、斑紋地蛤及紫云蛤?qū)俚拈L型紫云蛤聚簇、支持率為100%，與三者種間距離均為0.001 8，外群為蒴蛤?qū)俚膶ι舾?、紅樹蒴蛤(圖7)。

18S-28S rRNA(KX495219-20)分子量2 534 bp，含約800 bp的18S rRNA、800 bp的28S rRNA及近900 bp的ITS區(qū)序列，KX495219-20暫無種內(nèi)同源序列。櫻蛤總科ITS區(qū)系統(tǒng)樹中雙線紫蛤KX495219-20先與同科血蛤?qū)俚哪：显聘?N.obscurata)聚簇、支持率為98%，平均種間距離為0.266 2，后與櫻蛤科的波羅的海白櫻蛤、櫻蛤(Macomanasuta)相聚，外群為截蟶科的縊蟶(圖8)。

28S rRNA(KU555423)分子量1 539 bp，KU555423暫未有種內(nèi)同源序列，與亞當(dāng)斯紫蛤序列AB746862(1 407 bp)相似性為100.0%，遺傳距離為0.000 0，保守位點1 407個，變異位點0個、占0.0%，沒有簡約信息和自裔位點，A、T、C、G、A+T堿基平均含量分別為20.5%、18.3%、26.9%、34.3%、38.8%，A+T含量明顯低于G+C，沒有插入、缺失位點。紫云蛤科28S rRNA系統(tǒng)樹為兩個分支，較大分支中雙線紫蛤KU555423與亞當(dāng)斯紫蛤、同屬的綠紫蛤先后聚支，支持率均為100%，雙線紫蛤同綠紫蛤種間距離為0.006 6，尖紫蛤與紫云蛤?qū)俚拈L型紫云蛤和小紫蛤混支，大分支的外側(cè)為S.petalina；稍小分支由蒴蛤?qū)俚膶ι舾颉⒓t樹蒴蛤和地蛤?qū)俚纳渚€斜紋紫云蛤、中型地蛤、G.pusilla獨立小支匯成，系統(tǒng)樹外群為血蛤?qū)俚娜毡狙?圖9)。

2.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤野生群體示例樣本的總數(shù)為15枚，染色圖譜顯示閉殼肌和斧足肌中大部分同工酶的表達(dá)調(diào)控具有組織特異性，群內(nèi)個體同組織同種酶的條帶表型、共有酶帶活性和遷移較一致。EST為正染色、酶譜較復(fù)雜，閉殼肌的酶帶數(shù)有7～8條，斧足肌有4～5條或更多，組織特異性明顯，酶位點活性表達(dá)強弱不同，樣本個體間可見明顯多態(tài)性；IDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有3條，組織特異性明顯，酶帶活性表達(dá)強弱不同，個體間未見多態(tài)性；LDH為正染色，閉殼肌的酶帶有1或3條，斧足肌沒有酶帶，組織特異性明顯，酶位點活性表達(dá)強弱稍有不同，個體間沒有多態(tài)性；MDH為正染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有1條，組織特異性明顯，酶位點活性表達(dá)強弱較一致，個體間未見多態(tài)性；ME為正染色，閉殼肌的酶帶有3或4條，斧足肌有2條，組織特異性明顯，酶位點活性表達(dá)強弱有些許不同，個體間沒有多態(tài)性；SOD為負(fù)染色，閉殼肌的酶帶有2條，斧足肌有2條，組織特異性不明顯，酶位點活性表達(dá)強弱不同，個體間未見明顯多態(tài)性(圖10)。

注：A：酯酶(EST)；B：異檸檬酸脫氫酶(IDH)；C：乳酸脫氫酶(LDH)；D：蘋果酸脫氫酶(MDH)；E：蘋果酸酶(ME)；F：超氧化物歧化酶(SOD)；1：閉殼??；2：斧足肌。

Notes：A：EST；B：IDH；C：LDH；D：MDH；E：ME；F：SOD；1：Adductor muscle；2：Axe-shaped foot muscle.

3 討論

3.1 形態(tài)測定

南日島雙線紫蛤樣本的兩殼相等、呈長橢圓形，殼質(zhì)薄、解剖時邊緣受外力作用時易碎，灰紫色蛤殼表被有棕黃褐色的殼皮、同心圓狀生長線細(xì)密，部分2～3齡貝的殼皮延伸出蛤殼腹緣些許，喜深潛鉆穴并埋棲于潮間帶細(xì)沙內(nèi)生活，殼皮常有破損，自殼頂射出2條放射狀淺色的色帶至殼后腹緣，因殼皮伴隨著生長逐漸加厚、色澤逐漸加深，使幼貝的放射條紋較成貝更易于觀察(圖1)。測定結(jié)果顯示，隨著雙線紫蛤貝齡的增加，殼長、殼高、殼寬和體重參數(shù)變大，1齡貝的殼長體重比(0.77±0.16)、殼高體重比(0.37±0.07)分別降低至2～3齡貝的(0.17±0.03)、(0.08±0.01)，殼長殼高比相對較穩(wěn)定，生長過程中未發(fā)生明顯改變，個體的體重與殼高呈現(xiàn)出最高的相關(guān)性，其次是與殼長，而殼高和殼長也有著一定的關(guān)聯(lián)。合浦珠母貝(Pinctadafucata)[16]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[17]等的測定計算結(jié)果也表明，殼長、殼高、殼寬3個形態(tài)性狀與體重這一質(zhì)量性狀的相關(guān)性極顯著，輻射莢蟶(Siliquaradiata)[18]殼長與殼高的直線回歸關(guān)系亦較密切。同齡貝中，樣本個體間體重數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差波動范圍較大，推測其原因除個體自身營養(yǎng)、生理條件差異外，也可能是因為采捕時樣本受驚雙殼突然緊閉，體內(nèi)封入了一部分海水，即使多輪甩干、濾紙吸水以求降低海水含量，但后續(xù)解剖發(fā)現(xiàn)余存海水仍未完全消除而致。樣本的同貝齡個體間無明顯形態(tài)特征差異，可能是南日島雙線紫蛤種群的分布規(guī)模仍不夠理想、遺傳背景缺乏外來基因流入、交換相對穩(wěn)定以及所處生長環(huán)境較一致共同作用的結(jié)果。生物餌料投喂量和組成類型[1]、海區(qū)底質(zhì)[2]等多方面影響雙線紫蛤存活、生長與繁育，多元分析韌帶長、前后緣長等性狀指標(biāo)說明北部灣海區(qū)的雙線紫蛤4個地理群體間形態(tài)參數(shù)有不同程度的判別差異[3]，表明雙線紫蛤生長的環(huán)境因子不同會產(chǎn)生易區(qū)分的表型性狀差異，因此，可通過測定殼長等特征性狀，分析南日島雙線紫蛤群體與其他地區(qū)自然種群同貝齡樣本的形態(tài)差異程度。

3.2 序列擴增

南日島雙線紫蛤個體的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb、H3、18S rRNA、ITS區(qū)和28S rRNA標(biāo)記序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的過程中，部分序列在數(shù)據(jù)庫內(nèi)暫未有種內(nèi)同源序列，紫云蛤科內(nèi)檢索到的種間同源序列條數(shù)未能滿足軟件建樹最低數(shù)量條件要求，故將該部分序列的分析比對范圍擴大至櫻蛤總科，因此依據(jù)不同標(biāo)記序列所繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)不完全一致。DNA序列廣泛應(yīng)用于海產(chǎn)經(jīng)濟貝類如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[19]、牡蠣[20-21]、縊蟶[22]、泥蚶(Tegillarcagranosa)[23]、魁蚶(S.broughtonii)[24-25]、泥東風(fēng)螺(Babylonialutosa)[14]等的鑒定分類、群體遺傳和系統(tǒng)進(jìn)化分析，根據(jù)雙線紫蛤8種序列與同源序列的聚類結(jié)果、遺傳距離值大小、與當(dāng)前分類階元歸屬相對一致性與否，可選取COI標(biāo)記基因?qū)δ先諐u雙線紫蛤群體樣本的較多個體進(jìn)行測序，以了解本群體個體之間分子標(biāo)記是否有變異，或結(jié)合其它地理群體樣本序列分析種內(nèi)的變異情況。12S rRNA、Cytb發(fā)育樹中，產(chǎn)自南日島的雙線紫蛤序列和廣西北海的雙線紫蛤序列JN398363[13]聚在一起，但在16S rRNA、COI進(jìn)化樹中，二者的基因序列卻沒有率先聚支。紫云蛤科16S rRNA系統(tǒng)樹中，南日島雙線紫蛤與疑似同種異名的亞當(dāng)斯紫蛤[26]、同屬的中國紫蛤親緣關(guān)系更近，北海雙線紫蛤與同屬的中國紫蛤親緣關(guān)系最近，其次是亞當(dāng)斯紫蛤，種間遺傳距離值均小于不同地理位置雙線紫蛤的種內(nèi)距離；而紫云蛤科COI系統(tǒng)樹中，南日島雙線紫蛤能夠與同種的JN859948優(yōu)先聚集，且二者與中國紫蛤的進(jìn)化關(guān)系最近，其次為同屬的綠紫蛤，雙線紫蛤JN398363卻與蒴蛤?qū)俚募t樹蒴蛤具有更近的親緣關(guān)系，其次才是中國紫蛤。序列聚類分析和遺傳距離值計算結(jié)果表明，雙線紫蛤南日島個體與廣西北海個體存在一定水平的遺傳差異，福建莆田和廣西北海的地理距離使得位于不同產(chǎn)地的雙線紫蛤基因交流遇到有效程度的阻礙，隨時間累積，逐漸穩(wěn)定形成遺傳隔離，導(dǎo)致發(fā)生明顯的遺傳變異、分化，較大的種內(nèi)遺傳距離揭示有可能存在亞種或隱存種?？稍谝勋@得的12S rRNA、16S rRNA、COI、Cytb基因片段基礎(chǔ)上，通過設(shè)計長片段引物擴增、拼接南日島雙線紫蛤線粒體基因組全序列，與雙線紫蛤JN398363進(jìn)行線粒體基因組變異位點、堿基組成、氨基酸編碼、基因排列順序等情況做詳細(xì)的比較分析。綜合紫云蛤科16S rRNA和28S rRNA序列的種屬堿基組成、系統(tǒng)聚類、遺傳距離處理結(jié)果來看，基因數(shù)據(jù)同前人形態(tài)分類評價一樣，較傾向于支持紫蛤?qū)俚腟.diphos和S.adamsii為同種異名或隸屬于種的不同地理亞種，但最終分類關(guān)系的界定尚需二者群體樣本進(jìn)化速率更快的ITS、COI、Cytb乃至線粒體基因組等的分析數(shù)據(jù)和其他高可信度的分子遺傳學(xué)資料共同佐證。

3.3 同工酶電泳

南日島雙線紫蛤群體樣本的閉殼肌和斧足肌2種組織中所檢測的5種同工酶EST、IDH、LDH、MDH和ME在酶譜表型、分布和活性上均表現(xiàn)出明顯組織特異性，可能與雙線紫蛤2種組織的特異同工酶酶系統(tǒng)、組織結(jié)構(gòu)生理功能和代謝途徑及強度有關(guān)，幾種同工酶的基因在閉殼肌細(xì)胞和斧足肌細(xì)胞中的調(diào)控表達(dá)不同而直接或間接表現(xiàn)出差異；個體間同一組織中IDH、LDH、MDH、ME和SOD酶系統(tǒng)譜型基本一致。EST在閉殼肌和斧足肌中皆染色出較多的酶帶、且酶譜表型相較其他幾種復(fù)雜，IDH在閉殼肌和斧足肌中酶活性均不強，LDH在閉殼肌中酶活性稍弱，在所用檢測條件下，6種同工酶中僅LDH在斧足肌中未顯示出酶活性或激活表達(dá)極弱、電泳后不能染出可見酶區(qū)帶，MDH、ME在閉殼肌中酶活性較強、尤其是ME酶帶染色最深，二者在斧足肌的酶活性較閉殼肌弱、酶帶顏色很淡；SOD在閉殼肌和斧足肌中都有表達(dá)、未呈現(xiàn)出明顯組織特異性和個體活性差異，2種組織間泳動遷移較慢的負(fù)染色彌散區(qū)譜型表達(dá)具有微弱不同，但在所調(diào)整的緩沖液體系配比、增加上樣量等多輪電泳及重復(fù)染色條件下，酶活性表達(dá)均不強，可能與條件不適、組織生理狀態(tài)、抗氧化防御性或新陳代謝水平相關(guān)聯(lián)，酶譜部分負(fù)染色區(qū)域沒有形成清晰的條帶或界限，無法比較組織特異性或個體多態(tài)性。閉殼肌IDH、LDH、ME和斧足肌IDH、LDH酶譜中均有出現(xiàn)2條遷移較一致的負(fù)染色條帶，極個別位點檢測到3條負(fù)帶，在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[27]、泥東風(fēng)螺[14]等種群的遺傳變異分析中，類似現(xiàn)象亦有發(fā)現(xiàn)，可能是由于次生酶作用或蛋白無底物脫氫反應(yīng)而產(chǎn)生的。EST、ME和SOD的個別酶帶較粗、拖尾或彌散，或許不只是單一酶帶存在，分子量相近仍需探索提高分離膠濃度、延長電泳分離時間等。6種同工酶的初步電泳分析中，EST酶活性在2種組織中顯示出良好的組織特異性及個體間豐富的多態(tài)性，個體基因選擇性表達(dá)的調(diào)控不同直接體現(xiàn)在同工酶產(chǎn)物變化，這種變化反映在種群內(nèi)不同個體EST的酶帶表達(dá)增強或減弱而造成的條帶有無、活性強弱或數(shù)目差異，但共有酶帶泳動遷移位置未發(fā)生改變，表明南日島雙線紫蛤個體之間的遺傳分化因海區(qū)同質(zhì)化環(huán)境和基因有效交流作用變異程度不是很高；EST的編碼位點較多，酶譜表型穩(wěn)定重復(fù)性好，適于進(jìn)一步研究南日島雙線紫蛤群體內(nèi)同工酶多態(tài)性位點有無、多寡比例等指標(biāo)，是進(jìn)一步評價分析多種組織、不同貝齡、揭示群內(nèi)個體或異地種群間遺傳差異的理想工具酶。

致謝：實驗得到中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室茅云翔教授、福建省水產(chǎn)研究所福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室曾志南研究員及福建省南日島海洋生物技術(shù)有限公司陳珍賜先生的諸多支持，特此致謝。

[1]林祥志.幾種頭足類遺傳多樣性及真蛸與雙線紫蛤的繁育生物學(xué)研究[D].廈門：廈門大學(xué)，2007.

[2]黃建輝.雙線紫蛤Sanguinolariadiphos(Linnaeus)規(guī)模化繁育技術(shù)研究[J].福建水產(chǎn)，2013，35(5)：375-380.

[3]孫成波，劉建勇，陳梽.北部灣4個自然群體雙線紫蛤形態(tài)差異與判別分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2010，19(5)：583-587.

[4]潘輝，高如承，吳麗云，等.利用流式細(xì)胞術(shù)研究3種貝類的血細(xì)胞分類[J].福建師大學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011，27(4)：127-130.

[5]HWANG D F，NOGUCHI T，NAGASHIMA Y，et al.Occurrence of paralytic shellfish poison in the purple clamSoletellinadiphos(bivalve)[J].Nippon Suisan Gakk，1987，53(4)：623-626.

[6]HWANG D F，LU S C，NOGUCHI T，et al.Seasonal variations of paralytic toxins in purple clamSoletellinadiphos[J].Journal of the Fisheries Society of Taiwan，1990，17(4)：305-311.

[7]LU Y H，HWANG D F.Effects of toxic dinoflagellates and toxin biotransformation in bivalves[J].Journal of Natural Toxins，2002，11(4)：315-322.

[8]CHOU H N，HUANG C P，CHEN C Y.Accumulation and depuration of paralytic shellfish poisoning toxins by laboratory cultured purple clamHiatuladiphosLinnaeus[J].Toxicon，2005，46(5)：587-590.

[9]SHUE M F，CHEN W D，SU C C，et al.Heavy metals in bivalve mollusks collected from Da-Peng Bay Lagoon in south-southwestern Taiwan[J].Journal of Toxicology & Environmental Health Part A，2014，77(4)：214-222.

[10]LAGADE V M，TAWARE S S，MULEY D V.Seasonal variation in the biochemical constituents，percentage edibility and condition index of the estuarine clam，Soletellinadiphos(Linnaeus，1771)(mollusca：bivalvia：veneroida：psammobiidae)[J].International Journal of Zoological Research，2015，11(4)：127-139.

[11]TAWARE S S，LAGADE V M，MULEY D V.Oxygen consumption rate of the estuarine Psammobiid clamSoletellinadiphos(linnaeus)under various Environmental conditions.Indian[J].Indian Journal of Geo-Marine Sciences，2012，41(5)：468-472.

[12]LAGADE V M，TAWARE S S，MULEY D V.Seasonal variation in oxygen：nitrogen ratio ofSoletellinadiphosof Bhatye estuary，Ratnagiri coast，India[J].Journal of Environmental Biology，2013，34(1)：123-126.

[13]YUAN Y，LI Q，YU H，et al.The complete mitochondrial genomes of six heterodont bivalves(tellinoidea and solenoidea)：variable gene arrangements and phylogenetic implications[J].Public Library of Science ONE，2012，7(2)：1-9.

[14]王朋云.莆田南日島泥東風(fēng)螺的形態(tài)、DNA條形碼和同工酶初步分析[J].漁業(yè)研究，2017，39(4)：249-263.

[15]RICHARDSON B J，BAVERSTOCK P R，ADAMS M.Allozyme electrophoresis：a handbook for animal systematics and population studies[M].San Diego：Academic Press，1986：175-176，199-202，213.

[16]譚才鋼，劉寶鎖，張東玲，等.合浦珠母貝主要形態(tài)性狀與體質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)分析[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11(2)：35-40.

[17]王沖，孫同秋，王玉清，等.不同群體毛蚶形態(tài)性狀對重量性狀的影響效果分析[J].海洋漁業(yè)，2015，37(5)：427-433.

[18]劉德經(jīng)，謝開恩，李正華，等.輻射莢蟶(Siliquaradiata)生物學(xué)的研究[J].漁業(yè)研究，2017，39(3)：172-180.

[19]倪守勝，楊鈺，柳淑芳，等.基于線粒體Cytb基因的蝦夷扇貝群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2017，24(3)：432-439.

[20]王朋云.莆田后海養(yǎng)殖牡蠣的形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定[J].福建水產(chǎn)，2013，35(2)：100-105.

[21]巫旗生，寧岳，曾志南，等.福建沿海牡蠣養(yǎng)殖群體的多重種類特異性PCR分析和形態(tài)參數(shù)比較[J].福建水產(chǎn)，2014，36(1)：7-13.

[22]牛東紅，馮冰冰，劉達(dá)博，等.浙閩沿?？O蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星和線粒體COI序列分析[J].水產(chǎn)學(xué)報，2011，35(12)：1805-1813.

[23]林昕，王鵬，杜琦，等.福建沿海不同養(yǎng)殖區(qū)泥蚶的ITS-1基因片段序列分析[J].福建水產(chǎn)，2008，30(1)：61-65.

[24]周麗青，楊愛國，王清印，等.魁蚶4個地理群體ITS序列變異及系統(tǒng)發(fā)生分析[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2012，33(5)：78-84.

[25]陳楨，邱兆星，王鴻霞，等.基于COI和ITS基因?qū)酪吧后w和人工繁育子代的遺傳分析[J].海洋科學(xué)，2013，37(7)：24-32.

[26]HONDA J，WILLAN R C，SUZUKIDA K，et al.Discovery of healthy populations of the endangered bivalveSoletellinaadamsiiReeve，1857(tellinoidea：psammobiidae)on the Suo-nada Sea(western Set Inland Sea)coast of Yomaguchi Prefecture，western Japan，with taxonomic remarks[J].Yuriyagai，2001，8(1)：23-32.

[27]李太武，孫修勤，劉艷，等.櫛孔扇貝種群的遺傳變異分析[J].高技術(shù)通訊，2001，11(4)：25-27.