劉捷

（解放軍南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，南京 210002）

0 引言

小鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）可以在傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7內(nèi)生長并產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effects，CPE）[1]，因?yàn)樾∈笾Z如病毒是目前為止發(fā)現(xiàn)的僅有的能在體外進(jìn)行有效增殖的病毒株，因此可作為體外研究諾如病毒的理想材料，諾如病毒具有很強(qiáng)的抗原性，感染后發(fā)病主要表現(xiàn)為急性腸胃炎，現(xiàn)無可應(yīng)對(duì)其感染的疫苗[2]。通過研究不同刺激環(huán)境對(duì)小鼠諾如病毒在RAW264.7細(xì)胞中復(fù)制的影響，可有助于運(yùn)用傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)行小鼠諾如病毒的培養(yǎng)、增殖和分離[3]。對(duì)于除小鼠諾如病毒外其他種類諾如病毒的研究、檢測及疫苗研發(fā)工作有積極作用。試驗(yàn)通過比較不同培養(yǎng)條件下，使用RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)病毒的效果，探索培養(yǎng)液酸堿度，胰酶含量對(duì)小鼠諾如病毒在RAW264.7細(xì)胞中復(fù)制的影響。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)中使用的病毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定所得的小鼠諾如病毒；傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自上海紀(jì)寧；培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清購自維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；Hank's生物緩沖液由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；胰蛋白酶由武漢千潤生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器與設(shè)備有培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈等，見表1。

表1 試驗(yàn)儀器

儀器名稱 型號(hào) 產(chǎn)地超凈工作臺(tái) SW-CJ-IBU 蘇州凈化設(shè)備有限公司熒光顯微鏡 Olympus BX51 日本電熱恒溫培養(yǎng)箱 HNY-2112B 天津市歐諾儀器儀表有限公司

2 試驗(yàn)方法

2.1 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

試驗(yàn)用具消毒：超凈臺(tái)用酒精擦凈紫外照射20 min左右，試驗(yàn)前將培養(yǎng)液及藥品加溫到37 ℃，所有操作盡量靠近酒精燈火焰，防止細(xì)胞間交叉污染。

當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到瓶底70%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加PBS 10 mL漂洗1～2次，將漂洗液棄去。加入5 mL PBS，將細(xì)胞刮下后用移液槍反復(fù)吹打溶液，將有細(xì)胞的培養(yǎng)液分入新的培養(yǎng)瓶，放置到37 ℃、5% 的CO2孵箱中，幾小時(shí)后細(xì)胞即可再次貼壁生長。另外，定時(shí)觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)進(jìn)行傳代操作[4]。

2.2 細(xì)胞試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 不同酸堿度培養(yǎng)液對(duì)小鼠諾如病毒在RAW264.7細(xì)胞上適應(yīng)的影響

病毒的穩(wěn)定pH范圍為6.0～8.0，當(dāng)培養(yǎng)液的pH小于4.0或者大于9.0時(shí)，病毒的感染能力會(huì)被過酸或過堿的環(huán)境破壞，同時(shí)細(xì)胞的生長形態(tài)改變受其影響較小，因此在設(shè)計(jì)試驗(yàn)的pH范圍時(shí)，先將配置好的培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱里放至少15 min，使溶液的二氧化碳達(dá)到飽和，當(dāng)培養(yǎng)液溫度到37 ℃后，測量其pH。通過添加酸或堿，配置pH濃度梯度為6.0、6.5、7.5、8.0的DMEM培養(yǎng)液，接入已感染MNV的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置不變條件對(duì)照組。

2.2.2 不同胰酶濃度對(duì)小鼠諾如病毒在RAW264.7細(xì)胞上適應(yīng)的影響

設(shè)計(jì)試驗(yàn)的胰蛋白酶培養(yǎng)基中范圍為5、6、7 μg/mL，接入已感染MNV的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置一組不加胰酶的對(duì)照組。

2.3 病毒接種和細(xì)胞病變形態(tài)觀察

小鼠諾如病毒在感染宿主細(xì)胞后細(xì)胞病變表現(xiàn)為細(xì)胞邊緣不整齊，部分核固縮，細(xì)胞死亡等[5]。培養(yǎng)18 h后觀察細(xì)胞病變情況。

2.4 免疫熒光試驗(yàn)

將培養(yǎng)一段時(shí)間后的試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞孔中的營養(yǎng)液棄去，用PBS洗滌3次，室溫干燥后，預(yù)冷80%丙酮（4 ℃）固定10 min。PBS洗滌后充分干燥備用。加入兔抗MNV VP1多克隆抗體（實(shí)驗(yàn)室制備），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的熒光二抗（碧云天生物技術(shù)公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后備用，在熒光顯微鏡下觀察。

2.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，紀(jì)錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并制作數(shù)據(jù)表格。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞病變形態(tài)觀察

定時(shí)抽取接種了小鼠諾如病毒培養(yǎng)液中的細(xì)胞進(jìn)行觀察，在顯微鏡下觀測到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，正常形態(tài)下RAW264.7細(xì)胞為圓形、貼壁生長、生長速度較快、細(xì)胞難消化，在被病毒感染后，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞邊緣不整齊，部分核固縮，細(xì)胞死亡。

3.2 酸堿度對(duì)病毒在細(xì)胞中復(fù)制的影響

小鼠諾如病毒在培養(yǎng)液pH在7.5左右時(shí)，在巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的復(fù)制最活躍，在培養(yǎng)液pH為6.0～6.5時(shí)，病毒的復(fù)制最不活躍，見表2。

表2 不同pH下MNV感染RAW264.7情況

3.3 胰酶添加量對(duì)病毒在細(xì)胞中復(fù)制影響

小鼠諾如病毒在培養(yǎng)液胰酶添加量為6～7 μg/mL時(shí)，在巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的復(fù)制最活躍，見表3。

表3 不同胰酶添加量下MNV感染RAW264.7情況

4 結(jié)論

當(dāng)使用小鼠諾如病毒感染細(xì)胞后，由于病毒具有抗原的性質(zhì)，使感染后的巨噬細(xì)胞系RAW264.7在遇到相應(yīng)的抗體時(shí)發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)，在固定于培養(yǎng)孔上會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物。由于加入的第二抗體熒光素結(jié)合物仍然能與發(fā)生了抗原抗體特異性反應(yīng)的復(fù)合物結(jié)合，將會(huì)再次發(fā)生抗體抗原反應(yīng)，最后通過熒光發(fā)光。因此，可以通過觀察在熒光顯微鏡下熒光的有無和強(qiáng)弱，進(jìn)而判斷病毒在細(xì)胞中的復(fù)制情況。

試驗(yàn)表明，體外培養(yǎng)小鼠諾如病毒感染RAW264.7細(xì)胞時(shí)，當(dāng)控制其他變量恒定時(shí)，隨著培養(yǎng)液pH的改變，小鼠諾如病毒的復(fù)制在酸性條件下不變，在堿性條件下病毒復(fù)制速率加快。隨著胰酶添加量的增加，對(duì)小鼠諾如病毒的復(fù)制速率增加。通過對(duì)以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，小鼠諾如病毒在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中最佳培養(yǎng)條件是放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中當(dāng)DMEM培養(yǎng)液的pH為7.5左右或者胰酶的含量在6～7 μg/mL時(shí)，小鼠諾如病毒的復(fù)制速率加快。為便于觀測和試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，含有小鼠諾如病毒的細(xì)胞傳代次數(shù)應(yīng)控制在4代以內(nèi)。