俞建妹 劉芳 劉玉軍 沈遐 盧德陽

摘要：指出了對茶花“赤丹”進行組織培養(yǎng)，有利于芽誘導(dǎo)的外植體為一級分枝，通過試驗得出：較理想的芽增殖培養(yǎng)基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)6.7。

關(guān)鍵詞：茶花“赤丹”;組織培養(yǎng);芽誘導(dǎo);增殖

中圖分類號：S722.8 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-9944（2018）11-0060-03

1 引言

茶花“赤丹"（Camellia japonica‘Chidan）是山茶的一個品種，屬常綠灌木和小喬木，原產(chǎn)自中國華東地區(qū)，花朵碩大、艷麗、多變、活潑。但此品種較容易產(chǎn)生芽變，已形成一個龐大的“赤丹”系家族，其典型的突變品種有“粉丹”、“玉丹”、“鴛鴦鳳冠”、“鳳還巢”、“百萬富翁”和“醉楊妃”等，皆具有很高的觀賞價值。本研究的茶花“赤丹”花大紅色，花瓣70多枚，呈8～9輪排列，花瓣質(zhì)地厚，中型花，直徑10cm，完全重瓣型，為茶花珍品，常被茶花愛好者所青睞。為了能保持該種的優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性，規(guī)?；嘤涿缒緫?yīng)用于花卉市場，利用高科技的組織培養(yǎng)技術(shù)是最有效的途徑。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗材料來源于良鳳江國家森林公園（南寧樹木園）。以8年生，常年開花，花量大、花色艷麗的“赤丹”單株為對象，選擇根兜基部萌發(fā)的半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化，生長健壯的芽條作為外植體。

2.2 方法

2.2.1 外植體滅菌消毒

采集根兜萌芽條上一級、二級、三級半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化的枝條為外植體。在連續(xù)放晴3d以上的氣候采集枝條，首先剪去枝條的葉片，浸泡于5%洗衣粉溶液中，同時用軟毛刷輕輕擦洗表面污垢，流水沖洗30min，將剪成長約5cm（至少帶1個腋芽）的莖段，用75%乙醇處理30s，無菌水清洗3次后，0.1%HgCl₂溶液浸泡15min，無菌水沖洗4～6次，每次2～5min，切除莖段兩端受傷組織，接種于啟動培養(yǎng)基ER中。每級分枝接種100顆莖段，統(tǒng)計接種后第6～30d的外植體污染率和褐化率。

2.2.2 始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

張建華[1]等研究發(fā)現(xiàn)，ER培養(yǎng)基比較適合茶花樹組織培養(yǎng)，因此，本試驗始芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基選擇ER，6-BA、KT、ZT為芽誘導(dǎo)試驗的細(xì)胞分裂素。將上述3種級數(shù)的無菌外植體分別接種于①ER+6-BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L、②ER+KT1.0mg/L+IAA0.5mg/L、③ER+ZT0.5mg/L+IAAO.5mg/L的培養(yǎng)基內(nèi)。每種培養(yǎng)基接種每級數(shù)外植體20瓶，每瓶接種外植體1顆，3次重復(fù)。觀察記錄外植體始芽萌發(fā)時間、數(shù)量及其芽形態(tài)特征。

2.2.3 芽增殖培養(yǎng)

本試驗采用L9（34）方法，設(shè)計4個因素（基本培養(yǎng)基、6-BA、IAA、CH），每個因素3個水平，共9個處理，每個處理接種20瓶，每瓶接芽1顆，3次重復(fù)，培養(yǎng)50d統(tǒng)計新芽增殖數(shù)量，計算各處理芽增殖系數(shù)。

2.2.4 葉片黃化的遏制

在繼代芽培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)芽葉片黃化至死現(xiàn)象。根據(jù)芽的葉片黃化特點，開展①添加VC（抗壞血酸）10mg/L，②使用有濾網(wǎng)的封口膜、③調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值等試驗，每個處理接種20瓶，每瓶接芽5顆，3次重復(fù)，連續(xù)培養(yǎng)三周期，統(tǒng)計芽葉片黃化狀況。每周期30d。

2.3 培養(yǎng)條件

試驗除外，所有的培養(yǎng)基均附加白糖30 g/L，瓊脂5g/L，pH值為6.0。培養(yǎng)基在1.1mp，120℃高溫高壓條件下滅菌消毒20min。培養(yǎng)室溫度23℃±2℃，光照時間12～14h/d，光照強度800～3000Lx。新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)物，在800Lx光照條件下培養(yǎng)7～10d。

2.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013、SPSS18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同級數(shù)枝條滅菌的效果

連續(xù)15d采集萌芽條一級、二級、三級半木質(zhì)化或剛木質(zhì)化枝條進行滅菌消毒試驗，枝條滅菌消毒效果統(tǒng)計：一級分枝不污染率70%;二級分枝不污染率61%;三級分枝不污染率55%。由此得知，一級分枝較于二級、三級分枝枝條的污染率低9%～15%。一級分枝離主桿最近，養(yǎng)分充足，生長健壯，體內(nèi)營養(yǎng)運輸快，新陳代謝旺盛，在相同濃度相同殺菌劑的條件下，對殺菌劑傷害的抵抗力較強，加速了傷口自我愈合速度，以降低褐化枯死率，較多地獲取無菌活體，能為下一步外植體芽誘導(dǎo)提供較豐富的試驗材料。因此，一級枝條是滅菌消毒首選的外植體。

3.2 枝條級數(shù)與細(xì)胞分裂素對始芽誘導(dǎo)的影響

從表1可知，參試的細(xì)胞分裂素，在同一種類同一濃度條件下，芽誘導(dǎo)率大小排序為一級枝條>二級枝條>三級枝條。一級枝條始芽萌發(fā)需要的時間也最短，添加ZT的培養(yǎng)基，僅培養(yǎng)21d始芽萌發(fā)了，所以選擇一級枝條作外植體，有利于始芽的誘導(dǎo)，加快芽培養(yǎng)速度。此原因可能在于一級枝條直接萌發(fā)于主干。發(fā)育早期的組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較強，而發(fā)育晚期的組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較差，甚至無轉(zhuǎn)化能力[2]。在細(xì)胞分裂素對腋芽誘導(dǎo)及生長的影響中可知，KT、ZT與6-BA對一級側(cè)枝誘導(dǎo)芽作用存在顯著性差異。KT與ZT較6-BA更容易促進始芽萌發(fā)，但芽不健康。因此，適宜芽萌發(fā)的激素種類和濃度不一定適宜芽的生長。為了培育生長健壯的芽，利于下一步芽增殖培養(yǎng)，綜合始芽誘導(dǎo)率和芽形態(tài)特征表現(xiàn)，篩選出6-BA是比較適宜山茶“赤丹”外植體始芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素和濃度。

3.3 不同培養(yǎng)基配方對芽增殖效果的影響

從表2可知，6-BA對芽的增殖起主導(dǎo)作用。芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的遞增，總體呈向上趨勢，處理9除外，處理3和處理6芽增殖系數(shù)為高，分別是8.0和7.0。其次是處理2、處理5和處理8，芽增殖系數(shù)在5以上。但處理3和處理6的叢芽均出現(xiàn)不同程度的玻璃現(xiàn)象，而處理2和處理5的叢芽生長正常。原因可能是培養(yǎng)基中6-BA濃度為5.0mg/L，對山茶“赤丹”的莖尖和分生組織的細(xì)胞分化和生長刺激作用過大，加上在培養(yǎng)基中添加了營養(yǎng)豐富的CH，使培養(yǎng)物直接增殖不定芽形成試管苗的進程快、時間短，部分分生組織還沒能來得及適應(yīng)新的環(huán)境[3]，而導(dǎo)致細(xì)胞分化受損，細(xì)胞質(zhì)稀薄、細(xì)胞壁發(fā)育不良之故。CH對不定芽的分化和生長具有較強的促進作用，在含較高6-BA的培養(yǎng)基中添加CH濃度不宜過高。處理2和處理5中BA2.5mg/L，分別添加CH250mg/L和100mg/L，芽增殖系數(shù)雖然比處理3和處理6的分別低19.400，4.4%，但分化出的叢芽生長健康。本試驗采用的3種基本培養(yǎng)基，在適宜的6-BA和CH濃度條件下均能使增殖芽健康生長。為了能培育出較多的健壯芽用于進一步芽擴繁及生根，綜合考慮芽的增殖系數(shù)及生長情況，挑選出相對較優(yōu)的增殖配方為處理2。

3.4 不同方法對組培芽葉片黃化遏制效果的影響

一般情況下，茶花“赤丹”繼代芽培養(yǎng)到第6代時葉片出現(xiàn)黃化至枯死現(xiàn)象，為了改善或遏制此現(xiàn)象，根據(jù)茶花自然生態(tài)習(xí)性，將繼代了5代的“赤丹”增殖芽分別轉(zhuǎn)接到：①添加Vc10mg/L，②使用有濾網(wǎng)的封口膜封口，③調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到5.5這3種不同處理方法的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代，結(jié)果表明：第3種方法對培養(yǎng)物葉片黃化或褐化現(xiàn)象未得到良好的改善。添加Vc10mg/L的培養(yǎng)基中葉片黃化現(xiàn)象得到了有效的控制，新長出的葉片第二代培養(yǎng)時已沒有出現(xiàn)局部黃化或褐化現(xiàn)象，第三代培養(yǎng)時，芽得到正常生長。Vc是一種廣泛分布在植物中的維生素，在植物體內(nèi)參與電子傳遞系統(tǒng)中氧化還原作用，促進植物新陳代謝[4]，提高植物抵抗干旱、臭氧和紫外線作用。完整植株是能夠制造維生素的，但是離體卻不能合成足夠的維生素[5]?？赡苁请S著“赤丹”繼代芽生長速度的加快，Vc的合成不能滿足生長的需求，新陳代謝減弱而導(dǎo)致芽的葉片黃化。使用有濾網(wǎng)的封口膜能增加瓶內(nèi)氧氣輸人，促進芽的新陳代謝，葉片黃化程度有所改善，但其效果次于添加Vc的。所以，為了培養(yǎng)健康的增殖芽，宜在培養(yǎng)基內(nèi)添加Vc10mg/L或培養(yǎng)容器使用有封口膜的瓶蓋，能比較有效地遏制繼代芽葉片黃化現(xiàn)象。

4 結(jié)論與討論

根兜萌芽一級分枝滅菌消毒效果較好，且開始萌芽時間短。其是最佳始芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素，濃度為6一BA2.0mg/L，萌芽率高且始芽健壯，能有效地接種入芽增殖培養(yǎng)基為ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L中，叢生芽生長快速，有側(cè)芽萌發(fā)，增殖系數(shù)可達(dá)6.7，且能遏制或改善增殖芽葉片黃化枯死現(xiàn)象，能滿足生產(chǎn)化育苗需要，進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

適宜始芽誘導(dǎo)6-BA濃度低于芽增殖培養(yǎng)的濃度，原因可能是外植體來源于一級分枝幼嫩組織，養(yǎng)分充足，細(xì)胞活躍，分裂能力強，本身含有較高的生長激素水平，所以不需添加太多的外源激素，不定芽便能快速萌發(fā)。在瓶苗培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃化現(xiàn)象是否是培養(yǎng)物合成VC量不能滿足自己生長需求，引起自身氧化還原效率低，新陳代謝緩慢而引起葉片黃化，或是否芽生長代謝過程中排出的二氧化碳過多，培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣不足，造成二氧化碳中毒，引起葉片黃化，有待進一步的研究。

參考文獻：

[1]張建華，毛平生，彭火輝.茶樹的組培快繁技術(shù)初探[J].蠶桑茶葉通訊，2003（4）：32～33.

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[4]張洪昌，李星林.植物生長調(diào)節(jié)劑使用手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：118～119.