陳雅茜 ，樊 溢 ，Saad Abdelrahman，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.新英格蘭大學(xué)環(huán)境與農(nóng)業(yè)學(xué)院，澳大利亞 阿米代爾 2350）

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類非致病的對機(jī)體無害的好氧細(xì)菌，生長繁殖快，對消化道環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)力，在一定條件下產(chǎn)生芽孢，由于芽孢的特殊結(jié)構(gòu)使芽孢桿菌耐酸堿、耐高溫和耐擠壓，具有穩(wěn)定性好、抗性強(qiáng)、復(fù)活性高等優(yōu)勢[1]，在腸道酸性環(huán)境中可以穩(wěn)定生存，是國家允許使用的飼料微生物菌種，并可分泌較強(qiáng)活性的蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶等多種活性物質(zhì)[2]。鄺哲師等[3]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼養(yǎng)14 d后，添加芽孢桿菌制劑的試驗(yàn)組比對照組胃蛋白酶活性提高58.68%，胰淀粉酶活性提高24.05%，回腸內(nèi)蛋白酶和淀粉酶活性分別提高61%和20.3%，差異均顯著（P＜0.05）。陳連民等[4]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加巨大芽孢桿菌1259可以有效地改善產(chǎn)蛋中后期蛋雞生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)。大量研究表明，將單一飼用微生態(tài)制劑及復(fù)合產(chǎn)品添加到家畜飼料中，具有減少和替代飼用抗生素的作用[5-10]。

堿性蛋白酶（alkaline protease）被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、絲綢、制革等行業(yè)，是目前市場上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力。除了用于洗滌添加劑外，在21世紀(jì)初有人研究過蛋白酶脫毛，利用堿性蛋白酶處理羊毛也成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。郝建華[11]對一種新型海洋堿性蛋白酶的部分性質(zhì)及其在水解羊毛方面做了初步研究，結(jié)果表明，其具有良好的處理羊毛特性及發(fā)展?jié)摿?。由于微生物蛋白酶均為胞外酶，與動植物源蛋白酶相比具有易培養(yǎng)、產(chǎn)量高、成本低、生產(chǎn)快速、處理相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，而且堿性蛋白酶比中性蛋白酶具有更強(qiáng)的水解能力和耐堿能力，因此，堿性蛋白酶的研究成為蛋白酶研究的熱點(diǎn)[12-14]。由于堿性蛋白酶需求量大，能產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益，因此，篩選能產(chǎn)生堿性蛋白酶的新型菌株、通過適當(dāng)物理或化學(xué)手段提高產(chǎn)酶量和研究堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)一直是研究的熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)首先通過常規(guī)細(xì)菌分離純化方法將10株芽孢桿菌分離開，篩選出2株耐酸、耐膽鹽、能產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶的菌株，并測定其產(chǎn)蛋白酶的能力大小，通過微生物常規(guī)生理生化檢測結(jié)合分子生物學(xué)手段，鑒定出1株為短小芽孢桿菌，1株為Bacillus gobiens。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為從發(fā)酵食物中分離得到的10株芽孢桿菌。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基和產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基[14]。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化及形態(tài)觀察 將來自發(fā)酵食物中的10株芽孢桿菌混合菌液接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)24～36 h，取1 mL富集后的菌液用無菌生理鹽水作梯度稀釋，取100 μL 10-6菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，挑取不同菌落形態(tài)單菌落平板劃線分離培養(yǎng)，重復(fù)3～4次，可得純化的菌株并編號。觀察各菌株菌落形態(tài)，革蘭氏染色并鏡檢，挑取各菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 芽孢桿菌的耐酸性試驗(yàn) 在LB液體培養(yǎng)基中加入HCl至pH值為2.0，按0.5%接菌量分別接入純化后的各菌株，培養(yǎng)條件為37℃，180 r/min；未加HCl處理的培養(yǎng)基在同樣的條件下培養(yǎng)，作為對照。分別取酸處理1，2 h的菌液以及對照組菌液用無菌生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7濃度，每個梯度吸100 μL均勻涂布平板，重復(fù)3個平板，最后進(jìn)行平板菌落計數(shù)并算出平均數(shù)，計算存活率。

其中，C1為不同濃度菌液在酸處理不同時間的活菌平均數(shù)；C0為未做酸處理的菌液在對應(yīng)濃度及時間的活菌平均數(shù)；K為芽孢桿菌的存活率。

1.2.3 芽孢桿菌的耐膽鹽試驗(yàn) 在LB液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽至濃度為0.3%，培養(yǎng)條件同1.2.2；未加豬膽鹽的培養(yǎng)基在同樣的條件下培養(yǎng)，作為對照。分別取膽鹽處理1，2 h的菌液以及對照組菌液用無菌生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7濃度，每個梯度吸100 μL均勻涂布平板，重復(fù)3個平板，最后進(jìn)行平板菌落計數(shù)并算出平均數(shù)，計算存活率。

其中，D1為不同濃度菌液在膽鹽處理不同時間的活菌平均數(shù)；D0為未做膽鹽處理的菌液在對應(yīng)濃度及時間的活菌平均數(shù)。

1.2.4 芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶能力試驗(yàn) 用滅菌接種環(huán)挑取斜面保存的篩選菌株點(diǎn)種于產(chǎn)纖維素酶平板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)好的產(chǎn)纖維素酶平板中加入2 mL0.2%剛果紅水溶液顯色30 min，倒出顯色液，加入3 mL1 mol/LNaCl洗脫液15 min，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)水解圈。

1.2.5 芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力試驗(yàn) 用滅菌接種環(huán)挑取斜面保存的篩選菌株點(diǎn)種于產(chǎn)蛋白酶平板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。在產(chǎn)蛋白酶平板上直接觀察是否有透明水解圈出現(xiàn)。

1.2.6 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法繪制。

1.2.7 樣品蛋白酶活的測定 在300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中按1%接種量分別接種513-A和513-O，180 r/min，37℃培養(yǎng)24 h后離心，收集上清液并分別加入30%（NH4）2SO4固體攪拌，4 h后8 000 r/min冷凍離心，在上清液中緩慢加入70%（NH4）2SO4固體，邊加邊攪拌，整個過程都在冰浴上進(jìn)行，4℃過夜后冷凍離心，沉淀用10 mL PBS緩沖液溶解，透析，4 h換一次蒸餾水，用AgNO3檢測直到?jīng)]有白色沉淀為止，制成的粗酶液用于后續(xù)酶活測定。蛋白酶活力測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009中的樣品測定方法測定并計算酶活力大小。

1.2.8 菌株生理生化特征鑒定 生理生化試驗(yàn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]，對513-A和513-O分別進(jìn)行MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、丙二酸鹽利用、檸檬酸鹽利用、滲透壓試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化、酯酶試驗(yàn)。

1.2.9 分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌總DNA的提取按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒操作。以提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增引物為16S rDNA細(xì)菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，反向引物為 1429R：5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′。擴(kuò)增條件為 94℃ 4 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，30 個循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR純化產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測序。根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，在NCBI GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，再利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列匹配排列，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離和菌落形態(tài)觀察

將10株待測菌經(jīng)過革蘭氏染色并鏡檢，最終確定 K1，K2，K3，513-A，K8，513-O，K10，K11，K12，K13號菌株為革蘭氏陽性菌，呈直桿菌，芽孢近中生或端生，均為芽孢桿菌，觀察到的桿菌菌落形態(tài)描述列于表1；其中，513-A和513-O菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。

表1 10株芽孢桿菌菌落形態(tài)

2.2 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，10株芽孢桿菌中，最耐酸的是513-A菌株，pH值為2.0的酸處理1 h的存活率在70%左右，處理2 h的存活率也在50%以上；較耐酸的是513-O菌株，pH值為2.0的酸處理1，2 h的存活率都在50%以上；不耐酸的是K1，K2菌株，存活率分別為3.03%和0.77%。因此，篩選出513-A和513-O為2株耐酸芽孢桿菌。

2.3 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，這10株芽孢桿菌中，最耐膽鹽的是513-O菌株，0.3%膽鹽處理1 h的存活率在87%左右，處理2 h的存活率在70%左右；較耐膽鹽的是513-A菌株，0.3%膽鹽處理1 h的存活率接近70%，處理2 h的存活率在60%左右；不耐膽鹽的是K1，K10菌株，存活率分別在1%和10%左右；因此，篩選出513-A和513-O菌株為耐膽鹽芽孢桿菌，再結(jié)合耐酸試驗(yàn)結(jié)果，最終確定513-A和513-O菌株作為后續(xù)試驗(yàn)的菌種。

2.4 產(chǎn)酶能力試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 產(chǎn)纖維素酶定向分析 按照1.2.4的步驟進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，513-A和513-O菌株周圍均出現(xiàn)了透明圈，說明513-A和513-O菌株均有產(chǎn)生纖維素酶的能力，但能力大小不同。測量水解圈直徑可知，513-A菌株產(chǎn)纖維素酶能力要大于513-O菌株（圖5）。

2.4.2 產(chǎn)蛋白酶定向分析 按照1.2.4的步驟進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，513-A和513-O菌株周圍均出現(xiàn)了水解圈，說明513-A和513-O菌株均有產(chǎn)生蛋白酶的能力，但能力大小不同。測量水解圈直徑可知，513-O菌株產(chǎn)蛋白酶能力要大于513-A菌株（圖7）。

2.5 蛋白酶活力大小測定結(jié)果

2.5.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)酪氨酸不同含量所對應(yīng)的不同吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y為吸光度值，x為酪氨酸含量），如圖8所示。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝0.009 7x－0.005 1，R2＝0.999 3。

2.5.2 菌株蛋白酶活大小測定結(jié)果 按照1.2.7的方法進(jìn)行試驗(yàn)所得結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，513-A和513-O菌株均無酸性蛋白酶活性；513-O菌株的中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力均高于513-A菌株，分別為56.52，65.72 U/mL，且513-O菌株的堿性蛋白酶活力最大。

2.6 513-A和513-O菌株生理生化特征鑒定

513-A和513-O菌株生理生化特征列于表2，并參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒別。

表2 513-A和513-O菌株生理生化特征

2.7 分子生物學(xué)鑒定

分別以513-A和513-O這2個菌株細(xì)菌DNA為模板，16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了2條長度分別為1 426，1 441 bp的PCR產(chǎn)物；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果如圖10，11所示。

由圖10可知，菌株513-A和短小芽孢桿菌遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，測序結(jié)果顯示，513-A菌株與短小芽孢桿菌（KC771051.1）特異性序列同源性達(dá)到99%，且513-A菌株與短小芽孢桿菌生理生化特征十分相似，判定513-A菌株為短小芽孢桿菌。

由圖11可知，菌株513-O與Bacillus gobiensis遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，測序結(jié)果顯示，513-O 與 Bacillus gobiensis（NZ CP012600.1）特異性序列同源性達(dá)到99%，因此，推斷513-O菌株為Bacillus gobiensis。

3 討論

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類鑒定方法如菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色等，存在判斷粗略、誤差大等缺點(diǎn)，無法滿足現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)研究的發(fā)展要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，16S rDNA成為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用和最有效的分子指標(biāo)[17]，因?yàn)槠浞N類少，含量大，分子大小適中，約1.5 kb左右，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易得到其序列。一般認(rèn)為，16SrDNA序列同源性大于99%，可認(rèn)為屬于同一種；同源性為95%～98%可認(rèn)為是同屬不同種；同源性在95%以下可認(rèn)為不同屬[18-19]。本試驗(yàn)中對513-A和513-O的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物片段大小分別為1 426，1 441 bp，具有典型的16S rDNA特征。在GenBank中進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，513-A菌株與短小芽孢桿菌特異性序列同源性達(dá)到99%，并且其菌落形態(tài)和生理生化特性與短小芽孢桿菌基本一致，因而，可認(rèn)為513-A菌株為短小芽孢桿菌；513-O菌株與Bacillus gobiensis特異性序列同源性達(dá)到99%，說明屬于同一種，再結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，與Bacillus gobiensis親緣關(guān)系最近，故初步推斷513-O菌株為Bacillus gobiensis。除了16S，其他保守基因或者種的特有基因，以及多種分子生物學(xué)手段都能為菌種的鑒定提供一定證據(jù)。

由于動物體內(nèi)環(huán)境十分復(fù)雜，如胃液的酸性環(huán)境、腸道的膽鹽環(huán)境以及酶分解的作用等都是影響益生菌存活率的重要因素，因此，1株優(yōu)良的益生菌必須具備一定的耐酸性和耐膽鹽性[20-21]。芽孢桿菌能分泌促進(jìn)動物機(jī)體消化營養(yǎng)物質(zhì)的酶類，如淀粉酶、蛋白質(zhì)酶、纖維素酶等，從而提高動物對有機(jī)飼料的吸收利用率。本試驗(yàn)中篩選出的513-A和513-O菌株在pH值為2.0的酸性和0.3%膽鹽環(huán)境中能保持較高的存活率，具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力，這是其可作為飼料添加劑的前提；通過產(chǎn)酶定性試驗(yàn)得出，513-A菌株產(chǎn)纖維素酶能力優(yōu)于513-O菌株，意味著513-A菌株有較強(qiáng)的消化纖維素的能力；513-O菌株產(chǎn)蛋白酶能力優(yōu)于513-A菌株，意味著513-O菌株有較強(qiáng)消化蛋白的能力，因此，2個菌株均具有作為益生菌候選菌種的潛力。此外有研究表明，微生物飼料添加劑具有維護(hù)動物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、改善畜舍環(huán)境及凈化水質(zhì)[22]、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)等功能[23]。

目前，國內(nèi)外堿性蛋白酶主要應(yīng)用于洗滌及皮革等行業(yè)，90%以上洗滌劑均添加了堿性蛋白酶，且呈上升趨勢，因此，市場出現(xiàn)供不應(yīng)求的狀況[24]。堿性蛋白酶主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌中，研究較多的種屬有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜堿性芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、米曲酶、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、費(fèi)氏鏈霉菌、鐮刀菌等[25]。但我國常用于工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株種類還不夠豐富，品種較為單一。本試驗(yàn)中篩選出的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株513-O為Bacillus gobiensis，國內(nèi)外均鮮有報道，可作為產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌種類的一個補(bǔ)充，更加完善了產(chǎn)酶菌株體系；并且本試驗(yàn)對其生理生化特性以及產(chǎn)酶特性進(jìn)行了初步研究，填補(bǔ)了該菌株在這方面研究的空白。此外，本試驗(yàn)篩選出的2株菌株產(chǎn)堿性蛋白酶活力均不是很高，后續(xù)可通過適當(dāng)?shù)姆椒▉硖岣咚鼈兊漠a(chǎn)酶能力，如改變發(fā)酵條件、誘變育種或用基因工程手段在分子水平進(jìn)行定向改造等。

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