曹兵兵，高昉，姜勇，金勝威

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027；2.南方醫(yī)科大學 病理生理學教研室廣東省功能蛋白質(zhì)組學重點實驗室，廣東 廣州 510515）

創(chuàng)傷弧菌是一種生活在海洋中，嗜溫嗜鹽的革蘭氏陰性菌，與霍亂弧菌、副溶血弧菌同屬弧菌屬[1]。1970年ROLAND[2]第一次報道了由創(chuàng)傷弧菌感染引起小腿壞疽和內(nèi)毒素性休克，1979年FARMER[3]將它命名為創(chuàng)傷弧菌。創(chuàng)傷弧菌具有機會致病性，在全世界各地都有感染報道[2，4-5]，隨著氣候變暖和海上作業(yè)活動的增加，以及具有感染高危因素如飲酒、肝臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、糖尿病的人群增多，綜合導致創(chuàng)傷弧菌感染有增加的趨勢[6-7]。人感染創(chuàng)傷弧菌主要經(jīng)傷口以及誤食含菌的海產(chǎn)品，如生蠔、牡蠣等，而產(chǎn)生發(fā)熱、胃腸道反應、蜂窩織炎和皮膚損害等癥狀，晚期出現(xiàn)膿毒癥和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）死亡率超過50%。在美國每年由食物引起的死亡病例中，創(chuàng)傷弧菌引起的死亡人數(shù)占95%[7-8]。因此，了解創(chuàng)傷弧菌的致病機制對于預防創(chuàng)傷弧菌感染以及治療都有重要意義。目前研究主要集中在宿主防御、細胞毒性、細菌運動性、黏附相關(guān)蛋白等方面，近年來發(fā)現(xiàn)毒力調(diào)控和生物膜的形成在創(chuàng)傷弧菌致病中也發(fā)揮重要作用。

1 宿主防御

1.1 莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）大量研究認為CPS是創(chuàng)傷弧菌主要的致病因素之一[1，8]。CPS由創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生并分泌到細胞外，掩蓋細菌外部免疫原性結(jié)構(gòu)，不僅對抗補體系統(tǒng)的調(diào)理素作用和巨噬細胞的吞噬作用，幫助細菌逃避固有免疫監(jiān)視，還能決定細菌菌落形態(tài)，調(diào)控生物膜的形成[8]。一般認為編碼CPS的基因是在生物膜成熟后開始表達的，來限制生物膜大小，而CPS的表達調(diào)控是由多種因素決定的，如rfaH基因、細菌的群體感應（quorum sensing，QS）[9]。GARRETT等[10]研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌rfaH基因突變型幾乎不分泌CPS，在心浸液瓊脂（heart infusion，HI）培養(yǎng)基上表現(xiàn)出半透明表型，對機體的致病性也大幅度下降，易被機體清除，rfaH基因能夠調(diào)控CPS和血清抵抗，對細菌的毒力有重要影響。

1.2 酸中和 目前認為，創(chuàng)傷弧菌在胃中低pH的環(huán)境下，可以通過兩個機制來抵抗胃酸，達到酸中和目的[8]。首先，創(chuàng)傷弧菌能通過增加賴氨酸脫羧酶的表達，將賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺，中和胃酸和清除氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[11]。最近有研究[12]發(fā)現(xiàn)賴氨酸脫羧酶能夠影響生物膜的形成，賴氨酸的含量減少會使生物膜形成減少；其次，創(chuàng)傷弧菌的錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）表達上調(diào)，清除胞內(nèi)產(chǎn)生的過多的ROS，同時也可以達到酸中和的目的，從而增強細菌在胃酸中的生存能力，但具體的機制仍不清楚[13]。

2 鐵超載

機體血清鐵水平與機體感染創(chuàng)傷弧菌息息相關(guān)，在血清中鐵以游離鐵和結(jié)合鐵的形式存在，創(chuàng)傷弧菌通過多種鐵攝取系統(tǒng)在血液中獲得鐵，進行生長增殖。目前許多動物實驗和臨床資料顯示機體血清鐵升高通過多種途徑增加創(chuàng)傷弧菌感染，具體機制仍不清楚[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)鐵作為創(chuàng)傷弧菌生長發(fā)育機制的主要觸發(fā)因素，影響創(chuàng)傷弧菌整個生長過程[15]。在血中，鐵的濃度能夠影響創(chuàng)傷弧菌逃避固有免疫相關(guān)基因的表達，創(chuàng)傷弧菌主要的鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)UR）可以直接或間接抑制一種QS主要調(diào)節(jié)因子（smcR基因）的轉(zhuǎn)錄從而影響整個鐵攝取過程，PAJUELO等[15]首次報道了弧菌中FUR抑制細菌代謝調(diào)節(jié)因子（crp）和編碼跨膜DNA連接調(diào)節(jié)蛋白（toxR）基因表達。鐵調(diào)素作為機體分泌的鐵負性調(diào)控激素，能夠與膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferroportin1，F(xiàn)PN1）結(jié)合，抑制后者活性，并促進后者發(fā)生降解，間接調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)，當疾病狀態(tài)下如血液系統(tǒng)疾病血色素沉著病，鐵調(diào)素表達下調(diào)，會引起血清鐵增多，機體更易被創(chuàng)傷弧菌感染[16-17]。綜上所述，細菌的鐵攝取系統(tǒng)的調(diào)控以及人體內(nèi)鐵水平調(diào)控如鐵相關(guān)蛋白鐵調(diào)素、鐵轉(zhuǎn)運蛋白等將會成為今后研究的熱點。

3 細胞毒性

3.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） LPS在創(chuàng)傷弧菌感染機體形成內(nèi)毒素休克和膿毒癥占主要作用，也是創(chuàng)傷弧菌感染主要的致病因素之一[1，14]。LPS能夠通過影響體內(nèi)一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）的活性來發(fā)揮作用[8]；作為細菌生物膜的組成部分，LPS能夠發(fā)揮黏附作用促進生物膜的形成[18]。HORSEMAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷弧菌動物模型上，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和雌激素具有抵抗LPS的作用，降低死亡率，這也在一定程度上解釋了創(chuàng)傷弧菌感染時出現(xiàn)的男性患者遠多于女性的現(xiàn)象。

3.2 溶細胞素 溶細胞素是由vvhA基因編碼的分泌到胞外的外毒素，具有細胞毒性使細胞凋亡，并能破壞紅細胞使其向血中釋放鐵，然而具體在疾病中的作用仍不清楚[8]。有研究發(fā)現(xiàn)vvhA對于創(chuàng)傷弧菌的毒力并不是很大[19]，外源性膽固醇能夠使溶細胞素單體寡聚化，從而降低溶細胞素的活性。LEE等[20]研究發(fā)現(xiàn)，溶細胞素能夠通過PKCα和ERK/JNK-NF-κB途徑觸發(fā)腸道上皮細胞內(nèi)線粒體ROS的產(chǎn)生，進而導致細胞的壞死和凋亡。SONG等[21]報道在人腸道上皮Caco-2細胞模型上，創(chuàng)傷弧菌rVvhA通過操縱脂筏介導的c-Src/NOX信號通路和ERK/eIF2α激活，增加自噬流和自噬相關(guān)蛋白（LC3）形成，從而增加自噬相關(guān)的細胞死亡，損傷絨毛，破壞腸道正常結(jié)構(gòu)，促進創(chuàng)傷弧菌的生長增殖。

3.3 Rtx毒素A1（repeats-in-toxin A1，RtxA1）RtxA1能夠介導細胞死亡和組織壞死，通過多種途徑促進創(chuàng)傷弧菌在血液中的生長增殖和侵入，是創(chuàng)傷弧菌主要的致病因素之一。在細菌與細胞接觸后，RtxA1基因的表達增加，發(fā)揮細胞毒性，破壞腸道上皮細胞和腸道微絨毛結(jié)構(gòu)，在感染的早期發(fā)揮重要作用[22]。KWAK等[23]研究發(fā)現(xiàn)rtxA1基因存在4個變異區(qū)域，而每個區(qū)域?qū)煌男獏^(qū)域，編碼毒性不一的毒素，rtxA1基因的重排變異會導致新的菌株出現(xiàn)，毒性不同。KUO等[24]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌RtxA1能夠影響細胞外的鈣離子濃度，抑制細胞內(nèi)鈣離子外流，而細胞外鈣離子濃度對于血液中吞噬細胞發(fā)揮吞噬能力具有重要作用，從而增強了創(chuàng)傷弧菌在血液中的生存能力，避免細菌被吞噬消除。KIM等[25]研究發(fā)現(xiàn)一種多酚化合物白藜蘆醇能夠減少細菌的運動和黏附，下調(diào)RtxA1的表達和轉(zhuǎn)錄，減少RtxA1的細胞毒性從而起到一個保護作用。

3.4 胞外蛋白酶（extracellular proteases，ECPase） 創(chuàng)傷弧菌能產(chǎn)生各種各樣的ECPase發(fā)揮細胞毒性的作用，其中包括金屬蛋白酶（metalloprotease）、軟骨素酶（chondroitinase，ChSase）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）等。最近研究發(fā)現(xiàn)，VvpE是創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生的主要的金屬蛋白酶，能夠?qū)е陆M織壞死、皮膚損害和機體血管通透性改變，提示可能激活了血管內(nèi)緩激肽的產(chǎn)生，提示緩激肽在創(chuàng)傷弧菌致病過程中發(fā)揮了一定的作用；另外能夠降解IV型膠原纖維，激活Caspase-3前體，觸發(fā)細胞凋亡[14]。當然，也有研究發(fā)現(xiàn)，vvpE基因突變株與標準株相比，小鼠的死亡率并沒有下降，提示在創(chuàng)傷弧菌致病過程中VvpE可能并不是主要因素[26]。LEE等[27]研究發(fā)現(xiàn)VvpE能夠通過激活ROS依賴的PKCδ/ERK途徑，在粘蛋白分泌細胞HR29-MTX細胞上，刺激黏蛋白-2（mucin-2，Muc-2）基因啟動子的甲基化，從而抑制Muc-2的轉(zhuǎn)錄水平，而Muc-2由杯狀細胞產(chǎn)生，是腸道上皮屏障的重要組成成分，創(chuàng)傷弧菌通過VvpE的作用使腸道結(jié)構(gòu)完整性得到破化。VvpM是最近發(fā)現(xiàn)的一種金屬蛋白酶，具有蛋白水解能力，降解人體血管基膜，導致局部出血和皮膚壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，VvpM能夠通過ERK-細胞色素C-Caspases-9/3通路誘導細胞凋亡[28]。創(chuàng)傷弧菌分泌的另一種蛋白酶VvpS，具有肽聚糖水解酶活性，細菌在不同時期通過多種調(diào)節(jié)機制如賴氨酸家族調(diào)節(jié)因子（LeuO）、QS因子（SmcR）和總體毒力因子（CRP），調(diào)控VvpS基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響其表達水平[29]。

4 細菌運動性

4.1 鞭毛 創(chuàng)傷弧菌具有1條鞭毛，由6個鞭毛基因（flaA、flaB、flaC、flaD、flaE、flaF）編碼，其中flaB、flaD和flaC占主要作用[30]。一般認為，鞭毛與細菌的運動性、黏附性、細胞毒性、生物膜形成和侵襲有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌中的3種鐵攝取蛋白TonB系統(tǒng)（TonB1、TonB2、TonB3）的共同作用與細菌的致病性有關(guān)，且起到調(diào)控鞭毛蛋白表達的作用[31]。

4.2 菌毛 創(chuàng)傷弧菌菌毛由GANDER等[32]在1989年首次在電鏡下發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌表達IV型菌毛，由一種PilA蛋白質(zhì)組成，另一種蛋白質(zhì)PilD對菌毛的表達也發(fā)揮重要作用，PilD是一種酶，具有核酸內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。一般認為，菌毛與細菌的侵襲、黏附能力和致病性有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，敲除細菌IV型菌毛蛋白基因pilA能夠減少生物膜的形成，降低黏附能力，細菌的毒性也會下降[33]。除此之外，創(chuàng)傷弧菌基因組還存在另外一種編碼菌毛蛋白的基因，類似于霍亂弧菌的血凝素基因，其在創(chuàng)傷弧菌發(fā)病機制中的作用仍未知[33]。

5 黏附相關(guān)蛋白

5.1 膜外蛋白U（outer membrane protein U，OmpU） OmpU是創(chuàng)傷弧菌主要的一種膜外蛋白，它能夠與哺乳動物細胞外基質(zhì)的主要成分纖連蛋白結(jié)合，與細菌黏附功能有關(guān)。研究報道，OmpU的突變株與纖連蛋白的黏附能力只有野生型的4%，與RGD三肽結(jié)合能力為野生型的5%，與人喉表皮樣癌細胞HEp-2細胞的粘連能力是野生型的7%，細胞毒性是野生型的39%，半數(shù)致死量與野生型相差十倍[34]。

5.2 膜結(jié)合脂蛋白A（immunogenic lipoprotein A，IlpA） 創(chuàng)傷弧菌除了分泌OmpU蛋白之外，還存在IlpA，起到一個黏附素、免疫原性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌ilpA基因突變株相比于野生株，黏附能力明顯下降，進而使細胞毒性減弱[35]。最近報道顯示，IlpA能通過激活人單核細胞（THP-1）的Toll樣受體1/2，激活胞內(nèi)TLR1/TLR2、MyD88、MAPKs、NF-κB和AP-1途徑，觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，釋放大量的炎癥因子，具有同樣作用的還有細菌的CPS和VvpE[36]。

6 毒力調(diào)控

6.1 QS QS現(xiàn)象在細菌中較常見，細菌能合成并釋放一種自誘導物質(zhì)（autoinducer，AI）來調(diào)控細菌的許多生物行為。在創(chuàng)傷弧菌中，CPS、菌毛的合成受到QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[26，37-38]。SmcR作為AI-2信號，是細菌QS的主要調(diào)節(jié)因子，而SmcR是金屬蛋白酶基因vvpE轉(zhuǎn)錄的主要激活劑，同時SmcR能激活CPS相關(guān)基因的表達。最近研究發(fā)現(xiàn)SmcR能夠負性調(diào)節(jié)細菌生物膜的形成，對于創(chuàng)傷弧菌的侵襲和致病性具有重要意義，但其中具體機制尚不清楚[39]。

6.2 總體毒力調(diào)節(jié)因子 毒力調(diào)節(jié)因子cAMP-cAMP受體蛋白（cAMP-cAMP receptor protein，CRP）系統(tǒng)已被大量研究，CRP能夠結(jié)合在DNA上，影響基因的表達，包括溶細胞素、金屬蛋白酶和鐵攝取系統(tǒng)都受到CRP系統(tǒng)的調(diào)控。另一種毒力調(diào)節(jié)因子AphB具有廣泛的功能，具有包括酸中和、運動性、黏附性和致病性，最近有研究[40]發(fā)現(xiàn)AphB還能誘導腸道上皮細胞產(chǎn)生細胞因子白介素-8（interleukin-8，IL-8）。有趣的是，也有研究發(fā)現(xiàn)一些毒性基因如vvhA、vvpE和rtxA1并不受AphB的調(diào)節(jié)[41]。

6.3 溶血素U（hemolysin，HlyU） HlyU是創(chuàng)傷弧菌毒性主要的調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)rtxA1、vvhA和vvpE基因的表達，也被認為是細菌潛在的共同毒力調(diào)節(jié)因子。研究報道，rtxA1基因的表達受到H-NS阻遏物的抑制，而HlyU可以結(jié)合在rtxA1啟動子的上游，發(fā)揮去阻遏作用，使H-NS蛋白與DNA解離，從而使rtxA1正常表達，對于細菌侵襲至關(guān)重要[22]。最近有研究發(fā)現(xiàn)HlyU的結(jié)合位點是一段17個bp的回文序列，通過影響DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯從而調(diào)控創(chuàng)傷弧菌的毒力和致病性[42]。

7 生物膜

細菌形成生物膜能夠?qū)顾幬锖退拗髅庖呦到y(tǒng)的作用，增加了細菌感染人的能力，是一種非常重要的生存策略。創(chuàng)傷弧菌生物膜的成分由CPS、胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）和LPS等成分組成。生物膜的形成受到多種因素的影響，包括前文提到的CPS、鐵、LPS、菌毛、QS、HlyU等，其中LPS在生物膜的早期發(fā)揮重要作用，而CPS在生物膜成熟后產(chǎn)生，限制生物膜過度生長[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一種胞外基質(zhì)蛋白CabA在生物膜形成和維持結(jié)構(gòu)完整中發(fā)揮重要作用[43]。

8 其他致病因子

有研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌能利用唾液酸（sialic acid，SA）作為碳源進行生長繁殖，其中NanR蛋白發(fā)揮重要的作用，NanR蛋白是N-乙酰神經(jīng)氨糖酸基因的阻遏物，發(fā)揮調(diào)節(jié)唾液酸分解代謝的作用[44]。

9 展望

隨著氣候的變化和生活環(huán)境的改變，創(chuàng)傷弧菌這種機會致病菌的感染逐年增加。對于創(chuàng)傷弧菌的致病機制的研究能全面認識創(chuàng)傷弧菌，對預防感染和治療非常重要。創(chuàng)傷弧菌的致病機制尚未闡明，利用基因測序和定量蛋白質(zhì)組學的方法，通過高通量篩選技術(shù)和生物信息學分析方法找到創(chuàng)傷弧菌的潛在致病基因和毒力因子將會是以后的研究方向。

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