李璇璇 狄 揚 郝思介 金 忱 鐘 良

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化內(nèi)科1(200040) 胰腺外科2

胰腺囊性病變(pancreatic cystic lesions,PCLs)過去曾被認為是十分少見的疾病。隨著CT、MRI的普及和發(fā)展，其檢出率逐漸升高。根據(jù)所用影像學(xué)技術(shù)，PCLs的發(fā)病率有很大差異，腹部B超所得發(fā)病率為0.2%，CT為1.2%～2.6%，MRI為2.4%～13.5%[1]。然而Kimura等[2]的尸檢研究顯示PCLs的患病率高達24.3%。PCLs的鑒別診斷一直是臨床難點。一項納入330例偶然發(fā)現(xiàn)PCLs患者的回顧性研究[3]顯示，三分之一患者的術(shù)前診斷有誤。胰腺手術(shù)創(chuàng)傷極大，將良性病變誤診為惡性會給患者帶來不必要的手術(shù)風險，而將惡性或交界性病變誤診為良性則會顯著影響患者預(yù)后和生存率。因此提高PCLs的鑒別診斷水平具有重要臨床意義。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy,CLE)是近年來迅速發(fā)展的新技術(shù)，可實現(xiàn)內(nèi)鏡下細胞水平的觀察，使實時組織病理學(xué)檢查成為可能。其中細針型CLE(needle-based CLE,nCLE)尤其適用于PCLs的診斷[4]。本文對nCLE在PCLs中應(yīng)用的研究進展作一概述。

一、PCLs的分類和診斷現(xiàn)狀

PCLs可分為非腫瘤性病變和腫瘤性病變，前者包括胰腺真性囊腫和假性囊腫(pseudocyst)。胰腺假性囊腫是指胰腺內(nèi)或胰周異常體液潴留形成的囊腔，多見于急、慢性胰腺炎、外傷、胰腺手術(shù)后等，其囊壁沒有上皮細胞，可與真性囊腫區(qū)分[5-6]。腫瘤性病變最主要的類型有漿液性囊性腫瘤(serous cystic neoplasm,SCN)、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intra-ductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)、黏液性囊性腫瘤(mucinous cystic neoplasm,MCN)等，其中囊液為黏液性的IPMN和MCN惡變率較高，需盡早手術(shù)治療，而漿液性的SCN惡變罕見[7-11]，對SCN和非腫瘤性病變往往采取保守治療和隨訪。因此，臨床上鑒別PCLs的囊液是否為黏液性至關(guān)重要。其他PCLs還有實性假乳頭狀瘤、胰腺囊性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等。

目前PCLs診斷的主要依據(jù)是臨床表現(xiàn)、血清學(xué)檢查以及腹部B超、CT、MRI、內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下細針穿刺活檢(endoscopic ultrasonography-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)等。PCLs的臨床表現(xiàn)包括腹痛、胰腺炎、黃疸、消瘦、惡心等，但絕大多數(shù)患者無任何不適，在體檢時發(fā)現(xiàn)病變，因此癥狀無法指導(dǎo)診斷。血清學(xué)檢查中，PCLs無特異性腫瘤標志物，半數(shù)以上患者血清學(xué)檢查結(jié)果為陰性，鑒別診斷作用十分有限。腹部B超應(yīng)用廣泛，可觀察胰腺、胰腺導(dǎo)管和病灶，但存在明顯局限性。超聲波在到達胰腺之前經(jīng)過腹部脂肪、胃腸道等多層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰腺顯影不清，敏感性較差[12]。自CT、MRI廣泛應(yīng)用以來，PCLs的檢出率較以往明顯提升。多層螺旋CT(MSCT)空間和時間分辨率高、掃描速度快，對PCLs的診斷價值相對較高，文獻報道中其準確性范圍較大，在56%～85%之間[13-15]。MRI的準確性為78.9%～81.6%，但有文獻報道其觀察者間一致性相對較差[16-17]。

EUS結(jié)合傳統(tǒng)內(nèi)鏡與超聲的功能，其探頭透過十二指腸或胃壁進行胰腺檢查，分辨率高于CT和MRI，且可提示PCLs的侵襲性征象，包括囊內(nèi)分隔、囊壁結(jié)節(jié)、實質(zhì)性成分、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[15,18]。EUS檢查結(jié)果是操作者依賴性的，因此在準確性方面變異度大，其診斷PCLs的準確性在40%～96%之間[9]。對于黏液性與非黏液性PCLs的鑒別，EUS的敏感性、特異性、準確性分別僅為56%、45%和51%[19]。EUS-FNA是在EUS的引導(dǎo)下對病變部位進行細針穿刺以獲取細胞、組織或體液標本，從而獲得細胞學(xué)或病理學(xué)依據(jù)的檢查方法，目前被認為是胰腺疾病診斷最先進、準確的技術(shù)，抽吸囊液進行細胞學(xué)檢查已成為PCLs的標準檢查。兩項meta分析表明EUS-FNA細胞學(xué)區(qū)分黏液性與非黏液性PCLs的敏感性分別為63%和54%，特異性分別為88%和93%，敏感性較低但特異性較高[20-21]。臨床上有時可能因無法取到足量樣本而導(dǎo)致診斷率更低，一項試驗中其敏感性、特異性和準確性分別為34.5%、83%和59%[19]。在囊液腫瘤標志物的檢測中，CEA對于黏液性PCLs的鑒別最為準確，meta分析顯示其敏感性為63%，特異性為88%[21]。其他腫瘤標志物如CA19-9、CA125、CA72-4、CA15-3等準確性均很低[ 9,19]。綜合上述研究結(jié)果，EUS-FNA囊液分析敏感性欠佳。此外，EUS-FNA在PCLs中的應(yīng)用往往僅限于細胞學(xué)檢查，缺乏病理學(xué)診斷。

二、CLE概述

CLE是一種結(jié)合了微型聚焦激光掃描顯微鏡的新型內(nèi)鏡技術(shù)，其主要特點是鏡頭放大倍數(shù)可達1 000倍，對黏膜組織的觀察可達到細胞水平，因此在進行傳統(tǒng)內(nèi)鏡檢查時，CLE的使用可獲得與組織病理學(xué)相近的顯微圖像，實現(xiàn)實時組織學(xué)檢查，因檢測不需取活檢而被稱之為“光學(xué)活檢”。

CLE的工作原理為由主機激光器發(fā)射藍色低能耗激光束，經(jīng)光纖傳導(dǎo)后通過物鏡在被測部位聚集，組織中的熒光素被激光激發(fā)后發(fā)射出熒光，探頭在探頭孔后接收熒光信號，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳送至主機，在屏幕上形成放大數(shù)百上千倍的灰階圖像[22-23]。

CLE的實施需外源性熒光造影劑配合，早期常用的兩種熒光造影劑分別為0.05%鹽酸吖啶黃和10%熒光素鈉[22]。鹽酸吖啶黃可清晰顯示細胞核，但有致DNA突變風險，目前已極少使用。熒光素鈉價格低廉、安全性好、不致突變，目前仍在普遍使用。靜脈注射熒光素鈉20 s內(nèi)即可清晰顯像，并可持續(xù)約30 min，主要顯示血管和組織結(jié)構(gòu)，如上皮細胞、固有膜基質(zhì)、隱窩結(jié)構(gòu)、脈管系統(tǒng)等，缺點是不能顯示細胞核。熒光素鈉最常見的不良反應(yīng)包括一過性皮膚黃染、輕度惡心嘔吐、低血壓、過敏反應(yīng)等。

自問世以來，CLE已在Barrett食管、胃部疾病、炎癥性腸病、結(jié)直腸息肉等消化系統(tǒng)疾病中得到廣泛應(yīng)用，并逐漸擴展至膽胰疾病、肝臟疾病等，在其他?？萍膊∪绾粑到y(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病中也有應(yīng)用[22-29]。

CLE系統(tǒng)分為兩種，分別是基于內(nèi)鏡的整合式CLE (endoscope-based CLE,eCLE)和通過內(nèi)鏡活檢通道放置的探頭式CLE(probe-based CLE,pCLE)。eCLE內(nèi)鏡操作性較差，目前已很少使用。相比之下，pCLE使用便捷、探針多樣，適應(yīng)證廣泛。本文所關(guān)注的nCLE是目前最細的一種pCLE，可通過EUS-FNA的19G穿刺針，尤其適合探查胰腺。其由10 000根光纖組成，直徑僅0.85 mm，長4 m，觀察視野320 μm，橫向分辨率3.5 μm ，成像深度40～70 μm，一個探頭可進行約10次檢查[30-31]。

pCLE用于膽胰管狹窄的鑒別診斷已有Miami分類和Paris分類標準[23,32]。相比之下，其用于PCLs的鑒別診斷尚未形成一個行之有效的標準體系，許多團隊都在開展相關(guān)臨床試驗，為今后診斷標準的確立奠定了基礎(chǔ)。

三、nCLE的研究現(xiàn)狀

nCLE的第一個動物實驗研究發(fā)表于2010年。Becker等[33]成功應(yīng)用nCLE對豬的多個腹腔臟器進行實時組織學(xué)觀察，證實了nCLE在活體內(nèi)成像的可行性。2011年的文獻報道中，Mennone等[34]通過大鼠實驗證實nCLE可有效鑒別正常肝組織與肝硬化組織。

2011 年，Konda等[35]率先報道了nCLE用于胰腺占位性病變的可行性。研究納入18例行EUS-FNA的胰腺占位病例，其中16例為囊性病變，2例為實質(zhì)性病變；17例順利完成操作，10例圖像質(zhì)量為優(yōu)或良好。12例預(yù)置nCLE探頭的病例中，11例操作順利，6例后置nCLE探頭的病例中則有2例插入困難，1例操作失敗，由此認為預(yù)置nCLE的操作方式更為有效。該研究首次提出nCLE圖像中的絨毛樣表現(xiàn)可提示IPMN，并指出較之傳統(tǒng)EUS-FNA，nCLE實時成像可避免對正常組織進行不必要的活檢，從而減少穿刺次數(shù)。2013年，該團隊進一步報道了nCLE體內(nèi)鑒別PCLs的初步試驗INSPECT(InvivonCLE Study in the Pancreas with Endosonography of Cystic Tumors)結(jié)果[36]。該試驗中，消化病理醫(yī)師首先觀察26例PCLs病例的nCLE圖像，從中總結(jié)可區(qū)分胰腺囊性腫瘤與非囊性腫瘤的若干描述性特征，然后以之為標準解讀另31例PCLs病例的nCLE圖像，提出代表上皮絨毛結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)，包括手指狀突起、中空的暗環(huán)以及隱窩樣結(jié)構(gòu)等鑒別兩者的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確性分別為59%、100%、100%、50%和71%。

2015年，Nakai等[37]報道的DETECT(Diagnosis of pancreatic cysts: EUS-guided Through-the-needle confocal laser-induced Endomicroscopy and Cystoscopy Trial)試驗評價了SpyGlass光纖探頭與nCLE聯(lián)合對PCLs的診斷價值。SpyGlass系統(tǒng)系基于膽道子母鏡，用于膽胰疾病的診治，可在EUS的配合下將傳送導(dǎo)管、探頭送入胰腺病變部位進行觀察或活檢[38-39]。該試驗先通過SpyGlass觀察囊內(nèi)容物和囊壁，然后更換nCLE再次觀察，30例病例中僅1例探頭交換失敗。IPMN在SpyGlass下表現(xiàn)為手指樣突起和云霧狀黏蛋白，在nCLE下表現(xiàn)為乳頭狀突起和暗環(huán)；MCN在SpyGlass下表現(xiàn)為光滑的囊壁和混濁的囊液，在nCLE下可見上皮邊界；SCN在SpyGlass下有光滑的囊壁和明顯的脈管結(jié)構(gòu)，在nCLE下有淺表血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)。作者認為鑒別PCLs是否為黏液性尤為重要，指出SpyGlass見黏蛋白或nCLE見乳頭狀突起和暗環(huán)均提示黏液性PCLs，兩者敏感性分別為90%和80%，聯(lián)合使用敏感性可達到100%，鑒別診斷效能明顯提高。

同年報道的Napoléon等[40]開展的CONTACT(Clinical evaluation Of NCLE in The lymph nodes Along with masses and Cystic Tumors of the pancreas)試驗則主要針對SCN。研究根據(jù)18例患者的nCLE圖像總結(jié)制訂診斷標準，得出特異性的淺表血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)為SCN的診斷標準。在31例患者中對此標準進行驗證，特異性和陽性預(yù)測值均達到100%，敏感性和陰性預(yù)測值分別為69%和82%。次年，該團隊又報道了一項納入33例PCLs病例的研究[41]，指出MCN的nCLE表現(xiàn)為代表囊壁上皮邊界的灰色條帶；假性囊腫則表現(xiàn)為代表缺乏上皮細胞的炎癥組織顆粒，色澤可為明亮或灰黑。至此，INSPECT、DETECT、CONTACT三項臨床試驗結(jié)果成為nCLE鑒別診斷PCLs的主要參考標準[42]。

Karia等[43]2016年發(fā)表的研究將15例PCLs患者的nCLE圖像分發(fā)給6名內(nèi)鏡醫(yī)師進行解讀，旨在探討根據(jù)nCLE特征鑒別PCLs的觀察者間一致性，結(jié)果顯示其觀察者間一致性和診斷準確性均較低，6項nCLE特征的κ值最高僅0.22，平均診斷準確性僅為46%(20%～67%)。同年報道的Krishna等[44]的研究納入26例PCLs患者，其中手術(shù)患者占77%，nCLE診斷黏液性PCLs的敏感性、特異性和準確性分別為94%、82%和89%。該研究指出結(jié)合EUS-FNA組織學(xué)和囊液分析可提高鑒別診斷水平。2017年發(fā)表的Kadayifci等[45]的研究納入20例腫瘤直徑在2 cm以上的PCLs患者，nCLE診斷黏液性PCLs的敏感性、特異性和準確性分別為66%、100%和80%。2017年國內(nèi)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院團隊發(fā)表的臨床試驗報道，28例患者(其中17例為囊性或囊實性病變)成功進行EUS引導(dǎo)下nCLE檢查，均獲得質(zhì)量良好的圖像；26例獲得病理診斷的患者中，nCLE與病理診斷的符合率為73.1%，其中SCN和IPMN的診斷特異性均達到100%[46]。

四、nCLE的安全性、局限性和未來研究方向

nCLE檢查最常見的不良反應(yīng)為胰腺炎，現(xiàn)有臨床研究報道的術(shù)后胰腺炎發(fā)生率為3%～7%，其中以DETECT試驗和國內(nèi)試驗不良反應(yīng)發(fā)生率最高[37,46]。前者的可能原因為SpyGlass與nCLE聯(lián)合檢查耗時較長造成損傷，后者可能與國內(nèi)相關(guān)研究尚處于起步階段，操作熟練度不夠有關(guān)。而且國內(nèi)報道病例數(shù)尚少，缺乏代表性。其他還有個別病例發(fā)生一過性腹痛、囊內(nèi)出血等[35-36,47]，程度均較輕?？傮w而言，nCLE的安全性較好，但不良反應(yīng)發(fā)生率高于傳統(tǒng)EUS-FNA[48]。

nCLE的局限性之一是無法對PCLs的整個囊壁進行全面檢查，因其進針路徑有較為固定的方向，致使探頭掃描范圍受限。其次，nCLE的觀察平面平行于囊壁，而病理切片則是垂直于囊壁的切面，因此尋找對應(yīng)的特征性結(jié)構(gòu)有一定難度。此外，熒光素鈉無法顯示細胞核也會在一定程度上影響成像效果。目前的臨床試驗均為回顧性研究，樣本量亦有限。

未來研究方向是開展時間跨度更長、樣本量更大的前瞻性研究，可采取多中心合作的方式，進一步探索nCLE對PCLs的診斷價值，確立診斷標準。病理切片可平行于囊壁進行，從而有利于觀察在組織學(xué)上與nCLE圖像相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，IPMN囊壁的組織學(xué)亞型比囊腫大小或形態(tài)預(yù)測腫瘤進展的價值更高[37]，通過nCLE進一步鑒別其亞型也是未來的探索方向。開發(fā)可使細胞核染色同時對人體無害的熒光造影劑以提高nCLE成像的清晰度也是后續(xù)研究方向之一。

五、結(jié)語

nCLE可實現(xiàn)實時體內(nèi)組織學(xué)觀察，目前臨床試驗證明其能較為有效地鑒別診斷幾種常見PCLs，診斷特異性高，操作亦較安全，有較好的可行性和應(yīng)用前景，但觀察者間一致性有待提高。未來應(yīng)開展更多大規(guī)模臨床試驗，建立并完善nCLE標準診斷體系，這對提升PCLs的鑒別診斷水平具有重要意義。