胡 玲，馬 垚，胡 冰，余文雄，左 毅

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064)

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性疼痛性疾病。我國(guó)OA患病率約為15%，同時(shí)伴隨年齡的增長(zhǎng)，其患病率不斷升高，最終導(dǎo)致殘疾[1-2]。近年來(lái)的研究表明，微小RNA(miRNA)具有調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育及維持軟骨代謝平衡的作用，通過(guò)對(duì)其下游多靶點(diǎn)基因的干預(yù)，可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和修復(fù)，從而影響OA的病變過(guò)程[3]。miR-141是OA患者血液中具有高度特異性的miRNAs，其降低與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)，可影響OA的進(jìn)展；同時(shí)其可通過(guò)對(duì)炎性因子及神經(jīng)細(xì)胞中致痛因子的調(diào)控，從而對(duì)OA產(chǎn)生的疼痛具有調(diào)節(jié)作用[4]。miR-141家族在OA患者軟骨組織中的表達(dá)明顯高于正常組織[5],生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其能被特定的基質(zhì)金屬蛋白酶-16(MMP-16)所調(diào)控而影響骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。因此如何在早期阻斷關(guān)節(jié)軟骨的損傷，減輕或消除疼痛，改善關(guān)節(jié)功能，降低致殘率是OA研究領(lǐng)域中的重要課題。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀(guān)察OA模型大鼠背角神經(jīng)元中miR-141及軟骨組織中MMP-16的表達(dá)情況來(lái)探究它們的相關(guān)性及功能意義，以期為OA嚴(yán)重程度的判斷及靶向治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲食。環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度50%～70%，晝夜節(jié)律以1∶1進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗大鼠MMP-16抗體(博士德BA1280)，兔二步法檢測(cè)試劑盒(中杉金橋PV-6001)；miScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN-218161)、miScript SYBR Green PCR 檢測(cè)試劑盒(QIAGEN-218073)、1% 瓊脂糖、漩渦振蕩機(jī)(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；Heraguard EC 超凈工作臺(tái)( 美國(guó) Thermo Scientific公司) ；單道可調(diào)移液器(德國(guó) Eppendorf 公司)；CFX96 熒光定量PCR儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)；Power Pac Basic 電泳儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)；水平電泳槽(美國(guó) Bio-Rad 公司)。

1.3 分組及造模 將SD大鼠編號(hào)后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組20只和對(duì)照組10只。采用苯巴比妥麻醉大鼠，仰臥位固定，以左側(cè)膝關(guān)節(jié)作為手術(shù)側(cè)，常規(guī)備皮消毒。髕旁?xún)?nèi)側(cè)切口顯露膝關(guān)節(jié)，暴露髕骨后向外側(cè)脫位，盡量屈曲膝關(guān)節(jié)顯露前交叉韌帶，實(shí)驗(yàn)組直視下切斷前交叉韌帶，抽屜試驗(yàn)確認(rèn)完全切斷后徹底止血，將髕骨復(fù)位，1號(hào)絲線(xiàn)逐層閉合關(guān)節(jié)腔。對(duì)照組不切斷前交叉韌帶，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后大鼠手術(shù)側(cè)給予固定，分籠飼養(yǎng)，每只大鼠肌注青霉素20萬(wàn)IU/d預(yù)防感染，連續(xù)術(shù)后3 d。

1.4 冷痛閾測(cè)定 分別在手術(shù)前連續(xù)3 d以及手術(shù)2，8周后，于每天上午的固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量前將大鼠靜置入多孔鋼絲籠中，適應(yīng)環(huán)境15 min后，在右側(cè)皮區(qū)(右側(cè)為優(yōu)勢(shì)區(qū)，更加敏感)懸滴0.5 mL冷丙酮，記錄滴下冷丙酮后1 min內(nèi)后爪抓撓皮區(qū)或理毛的次數(shù)，重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min，取3次記錄值的平均值作為冷痛閾值。

1.5 軟骨組織病理切片觀(guān)察 2組分別于手術(shù)2，8周后各斷頸處死一半大鼠，取2 cm×0.5 cm軟骨組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，即行多聚甲醛固定、脫鈣、沖洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片，通過(guò)蘇木精-伊紅染色觀(guān)察大鼠骨關(guān)節(jié)的形態(tài)變化。

1.6 背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-141表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)。斷頸處死大鼠后取L4—6脊髓組織，分離出雙側(cè)脊髓背角組織，提取總RNA，在熒光定量PCR儀上按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行反應(yīng)。按照反應(yīng)體系配置說(shuō)明配備總反應(yīng)液25 μL：其中2×Quantiect SYBR Green PCR 12.5 μL，10×miscript Universal Primer 2.5 μL，10×miscript Primer Assay 141 2.5 μL，RNase-free water 5 μL，Template CDNA 2.5 μL，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變5 min，1個(gè)循環(huán)。15 s 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 70 ℃，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算2-ΔΔCT值進(jìn)行定量分析，2-ΔΔCT值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 MMP-16蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)。取4 μm厚的軟骨組織切片，常規(guī)脫蠟至水，0.3% H2O2孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)，高壓2 min抗原修復(fù)，冷卻至室溫。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗(MMP-16濃度為1∶200)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30 min。0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹(shù)膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。鏡下陽(yáng)性細(xì)胞核呈深淺不一的棕色，隨機(jī)10個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)前后大鼠冷痛閾值比較 手術(shù)2，8周后，對(duì)照組大鼠對(duì)冷丙酮刺激的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)未見(jiàn)明顯變化(P均>0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠對(duì)丙酮刺激的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠手術(shù)前后冷痛閾值比較次)

注：①與手術(shù)前1 d比較，P<0.05；②與手術(shù)后第2周比較，P<0.05；③與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.2 大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(xiàn) 對(duì)照組大鼠假手術(shù)2周和8周后HE染色表現(xiàn)無(wú)明顯變化，軟骨細(xì)胞形態(tài)扁平，排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)充血增生，間質(zhì)內(nèi)無(wú)纖維化。實(shí)驗(yàn)組大鼠手術(shù)2周后軟骨細(xì)胞發(fā)生收縮，數(shù)量增多、排列紊亂，基質(zhì)染色減退，此時(shí)發(fā)生以巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為主的急性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)明顯的增生血管和輕度纖維化；手術(shù)8周后，大鼠軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)消失，可見(jiàn)成團(tuán)積聚的炎癥細(xì)胞出現(xiàn)，同時(shí)組織裂隙較深，基質(zhì)不可染色，出現(xiàn)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變。見(jiàn)圖1～3。

圖1 假手術(shù)2周后對(duì)照組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(xiàn) (×100)

2.3 大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-141相對(duì)表達(dá)量 手術(shù)2，8周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-141相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且手術(shù)8周后明顯高于手術(shù)2周后(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 手術(shù)2周后實(shí)驗(yàn)組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3 手術(shù)8周后實(shí)驗(yàn)組大鼠滑膜軟骨組織HE染色表現(xiàn)(×100)

組別n手術(shù)2周后手術(shù)8周后對(duì)照組513.43±2.3414.54±3.82實(shí)驗(yàn)組1028.54±62.72①34.56±7.98①②

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與手術(shù)2周后比較，P<0.05。

2.4 大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組大鼠假手術(shù)2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠手術(shù)2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且手術(shù)8周后明顯高于手術(shù)2周后(P<0.05)。見(jiàn)圖4～6。

圖4 假手術(shù)2周后對(duì)照組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)情況(×100)

3 討 論

OA作為一種累及關(guān)節(jié)軟骨的慢性退行性病變，其病因尚不清楚，患者主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛及腫脹，這與軟骨及其微環(huán)境的合成代謝障礙所致的胞外基質(zhì)(ECM)退化和關(guān)節(jié)軟骨的損傷有關(guān)，隨著軟骨的破壞、外界機(jī)械因素刺激以及游離物質(zhì)的析出，導(dǎo)致疼痛加劇及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形[6-7]。miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度為22個(gè)小核苷酸，來(lái)源于內(nèi)源染色體上的非編碼單鏈RNA，它們?cè)谶M(jìn)化上具有高度的保守性，能夠通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA 降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。參與細(xì)胞增殖凋亡、器官形成、炎癥免疫應(yīng)答、炎性疼痛、腫瘤發(fā)生等進(jìn)程[8]，近年來(lái)研究表明miRNAs的表達(dá)差異與OA發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨細(xì)胞凋亡、滑膜炎癥以及疼痛等病理變化關(guān)系密切[9]。miR-141是一種在軟骨組織中表達(dá)的miRNAs。張文明[5]發(fā)現(xiàn)在成骨過(guò)程中，miR-141是成骨負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制降低Dlx5/Msx2/Runx2信號(hào)軸的級(jí)聯(lián)作用，減少成骨表達(dá)和成骨作用。申發(fā)娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-141高表達(dá)的胃腺癌SGC-901細(xì)胞E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin、MMP-9表達(dá)減少，細(xì)胞遷移減少。這些都提示miR-141與骨細(xì)胞代謝生長(zhǎng)、腫瘤、炎癥有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)2，8周后背根神經(jīng)節(jié)組織中miR-141表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，且手術(shù)8周后高于手術(shù)2周后，表明隨著OA的發(fā)展，miR-141呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。另外手術(shù)2周和8周后實(shí)驗(yàn)組大鼠對(duì)丙酮刺激的陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)明顯高于對(duì)照組，且隨著病情進(jìn)展其陽(yáng)性反應(yīng)次數(shù)明顯增加。推測(cè)脊髓背根神經(jīng)元中miR-141升高可以導(dǎo)致OA疼痛的發(fā)生，并可反映嚴(yán)重程度。

圖5 手術(shù)2周后實(shí)驗(yàn)組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)情況(×100)

圖6 手術(shù)8周后實(shí)驗(yàn)組大鼠軟骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)情況(×100)

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，MMP-16在OA發(fā)病中的作用備受關(guān)注。Nobuaki等[11]發(fā)現(xiàn)IL-1β通過(guò)Wnt16信號(hào)通路誘導(dǎo)MMP-16產(chǎn)生并促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，但在OA患者中發(fā)現(xiàn)MMP-16不僅可以降解ECM，而且也可以激活MMP-2在酶原水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解，這都促進(jìn)了OA的發(fā)展[12]。Zhang等[13]證實(shí)下調(diào)miR-155可以導(dǎo)致MMP-16的基因表達(dá)增加，降解ECM，從而引起椎間盤(pán)疾患，而上調(diào)MMP-16的表達(dá)可達(dá)到治療腰椎間盤(pán)突出的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠手術(shù)2，8周后骨組織中MMP-16蛋白表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，且手術(shù)8周后明顯高于手術(shù)2周。這表明MMP-16在OA的病理過(guò)程中起到降解軟骨細(xì)胞，促進(jìn)病情發(fā)展的作用。

綜上所述，在OA的發(fā)展過(guò)程中，脊髓背角細(xì)胞中的miR-141可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛，而MMP-16可以競(jìng)爭(zhēng)性地降解軟骨細(xì)胞ECM，促進(jìn)OA的發(fā)展。兩者相互作用促進(jìn)病情的發(fā)展，最終可能導(dǎo)致OA晚期出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛和畸形，但兩者之間如何互相調(diào)節(jié)還有待于進(jìn)一步研究。

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