張 弘，李 影，張玉軍，朱金峰，劉世亮*，申鳳敏，劉 芳，姜桂英*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，河南 鄭州 450002； 2.河南中煙工業(yè)有限責任公司洛陽卷煙廠，河南 洛陽 471000；3.河南省煙草公司漯河市公司，河南 漯河 462000)

作為煙草(NicotianaL.)生長的敏感元素，氮素的施用量直接影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。然而氮素在土壤中極易損失，利用率較低。近年來生物炭的施用不僅能改善土壤物理性狀，提高氮素利用率，且在烤煙的生長和品質(zhì)提升方面效果顯著[2-7]。有研究表明施用生物炭在移栽后前60 d對烤煙株高、莖圍、最大葉面積等農(nóng)藝性狀有抑制作用，但60 d后產(chǎn)生促進效果[8]。除農(nóng)藝性狀外，施氮量水平及生物炭施用對煙草中主要酶活性也有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)，施氮量對酶活性具有一定的調(diào)控作用，硝酸還原酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶的活性隨施氮量的增加逐漸升高[9-10]。而適當添加生物炭有利于提高旺長期烤煙中硝酸還原酶的活性，以及烤煙旺長期與現(xiàn)蕾期烤煙轉(zhuǎn)化酶活性的提高，同時可以提高烤煙旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期淀粉酶的活性[11]。另有研究表明，生物炭和施氮量對烤煙的化學組成和香氣組分有一定影響。趙殿峰等[12]發(fā)現(xiàn)，適宜添加生物炭有利于烤煙生長以及改善烤煙化學成分協(xié)調(diào)性。劉卉等[13]也認為，生物炭能進一步改善鉀氯比、糖堿比、糖氮比。施氮量對烤煙品質(zhì)的影響則表現(xiàn)在煙葉總糖、還原糖隨施氮量的增加而增加，施氮量與中性致香物質(zhì)總量呈正相關[14]。肖戰(zhàn)杰等[15]研究顯示，常規(guī)施肥配合生物炭可使烤后煙樣的中性致香成分含量更接近于優(yōu)質(zhì)煙葉的適宜范圍。由此可見，生物炭與施氮量對烤煙生長及品質(zhì)調(diào)控方面都起到較好作用，但是當前大多研究單一的施氮量或生物炭對烤煙的影響，而對在生物炭改良烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎上施用不同氮水平的研究很少，因此，在生物炭改良烤煙品質(zhì)的基礎上研究施氮量對烤煙品質(zhì)及碳氮代謝的影響具有重要的科學意義。

河南省作為我國優(yōu)質(zhì)濃香型煙葉產(chǎn)地，由于植煙土壤連作時間長，土壤結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，導致煙葉氮含量和煙堿含量普遍過高，從而影響煙葉品質(zhì)，使典型濃香型風味淡化，因此需要通過增施高碳含量有機物料調(diào)節(jié)土壤C/N比，結(jié)合植煙土壤生物炭施用量最佳范圍為1 200～1 600 kg·hm-2[16-17]，本研究采用大田試驗，在1 600 kg·hm-2生物炭施用量下，探索生物炭對烤煙生長及品質(zhì)的影響，并在此基礎上施用不同水平的氮，以期為河南省植煙土壤在生物炭改良條件下篩選最佳施氮量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年在河南省臨潁縣大郭鎮(zhèn)進行，土壤類型為黃褐土。試驗地基本理化性狀為有機質(zhì)16.2 g·kg-1，堿解氮52.8 mg·kg-1，速效磷20.89 mg·kg-1，速效鉀159 mg·kg-1，pH值7.74。

氮肥為尿素(含氮量45%)，磷肥和鉀肥分別為過磷酸鈣(含P2O5量12%)和硫酸鉀(含K2O量50%)。煙草品種為中煙100。

1.2 處理設計

試驗設5個處理：1)CK (不施生物炭和氮肥)，施Ca(H2PO4)2437.5 kg·hm-2，K2SO4367.5 kg·hm-2；2)N0(不施氮肥)，施生物炭1 600 kg·hm-2，Ca(H2PO4)2437.5 kg·hm-2，K2SO4367.5 kg·hm-2；3)N1，施生物炭1 600 kg·hm-2，N 37.5 kg·hm-2，Ca(H2PO4)2437.5 kg·hm-2，K2SO4367.5 kg·hm-2；4)N2，施生物炭1 600 kg·hm-2，N 52.5 kg·hm-2，Ca(H2PO4)2437.5 kg·hm-2，K2SO4367.5 kg·hm-2；5)N3，施生物炭1 600 kg·hm-2，N 67.5 kg·hm-2，Ca(H2PO4)2437.5 kg·hm-2，K2SO4367.5 kg·hm-2。其中N 52.5 kg·hm-2為當?shù)責熮r(nóng)常用氮肥施用量，且該處理N∶P2O5∶K2O為1.0∶1.0∶3.5，其他處理的磷鉀肥用量與該處理相同。重復3次，小區(qū)面積66.7 m2，隨機區(qū)組排列。氮鉀肥基追比為7∶3(70%的氮鉀肥做基肥，30%追肥)，基肥采用25～30 cm寬度開溝雙條施肥，然后起壟。追肥于移栽37 d后施用，追肥位置是煙行兩側(cè)最大葉葉尖所指位置(距離煙株15～20 cm)。

煙苗于2016年5月9日進行移栽，按1.22 m的行距和0.50 m的株距種植，并在2016年8月20日采收完畢。小區(qū)周邊種植2行煙草為保護行，其他按當?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙規(guī)范化栽培管理方式進行。

1.3 樣品的采集與測定

在煙苗移栽后30 d、60 d和90 d，選擇3棵長勢一致的煙草測量煙草的株高、葉長、葉寬、莖圍、有效葉數(shù)，葉面積根據(jù)“葉面積=葉長×葉寬×0.6345”計算[18]，用于測定酶活性的煙葉采集后放入冰盒立即帶回實驗室進行酶活性的測定；其余煙葉放入烘箱中105 ℃殺青，60 ℃烘干粉碎后待測定煙葉常規(guī)化學成分。采用磺胺比色法(活體法)測定硝酸還原酶活性[19]，3,5-二硝基水楊酸法測定淀粉酶活性[19]和轉(zhuǎn)化酶活性。煙葉氮含量采用凱氏定氮法，煙葉磷含量采用釩鉬黃比色法，煙葉鉀含量采用火焰光度計法[20]測定。

煙葉成熟期采收的煙葉均分別掛牌綁稈裝入同一烤房烘烤，烘烤過的煙葉按照上、中、下3個部位進行分類，挑選等級相近的煙葉粉碎后過0.2 mm篩后保存供烤后煙葉常規(guī)化學成分和香氣物質(zhì)檢測使用。其中，各處理不同部位的煙葉，首先嚴格按照我國的煙葉分級標準進行分級[21]，再進行取樣。上部葉取上桔二(B2F)，中部葉取中桔三(C3F)，下部葉取下桔二(X2F)。煙葉總糖、還原糖、煙堿、鉀、氯等常規(guī)化學成分含量按照王瑞新等[22]的方法測定；同時選取中部葉(C3F)測定煙葉香氣物質(zhì)含量，在國家煙草栽培生理生化研究基地采用固相微萃取頂空取樣和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)進行分析，具體操作參照劉世亮等[23]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 7.05軟件，采用Duncan新復極差法，比較不同處理間各種指標之間的差異；使用OriginPro 8.5進行相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對煙株農(nóng)藝性狀的影響

烤煙營養(yǎng)生長外觀優(yōu)劣主要表現(xiàn)在株高、葉長、葉寬、莖圍、有效葉數(shù)和葉面積等農(nóng)藝指標上。從表1可知，各處理在整個烤煙生育期內(nèi)，煙株呈快速生長趨勢，與CK相比，增施生物炭的N0處理的各農(nóng)藝性狀指標并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，只在移栽后90 d時葉數(shù)顯著大于CK，而增施氮肥處理(N1、N2、N3)的株高、葉長、葉寬、葉數(shù)和葉面積在移栽后60 d和90 d顯著高于CK，其中N3株高最高為105.5 cm，葉長最長為71.0 cm，葉面積最大為1 825.1 cm2，N1的葉數(shù)最多為22片，顯著高于其他處理，這是因為烤煙在移栽后60 d旺長期時大量需求氮素，增施氮肥的處理為烤煙提供了充足氮素所致，但對莖圍并無顯著影響，說明增施氮肥可顯著促進烤煙的生長發(fā)育。

表1 不同處理移栽后不同天數(shù)煙株的農(nóng)藝性狀

注：表中同列小寫字母不同表示5%差異顯著水平，表2～3同。

2.2 對烤煙碳氮代謝酶活性的影響

硝酸還原酶是高等植物氮素同化的限速酶，其活性強弱反映氮代謝的強弱[24]。圖1中顯示，各處理的硝酸還原酶活性，總體呈降低趨勢。其中，各處理的硝酸還原酶活性在移栽后30 d時達到最大值，且N3的活性最大為51.19 μg·g-1·h-1，隨后明顯降低，除N3外，其他處理硝酸還原酶活性在移栽后90 d時降到最低，說明烤煙氮代謝，主要發(fā)生在其生長前期。與CK相比，N0增施生物炭在移栽后60 d時可以顯著提高煙葉硝酸還原酶活性，而增施氮肥對煙葉硝酸還原酶活性并未表現(xiàn)出明顯規(guī)律。

同一移栽后天數(shù)不同處理間不同小寫字母表示5%差異顯著水平，圖2同圖1 不同處理移栽后不同天數(shù)烤煙硝酸還原酶、淀粉酶和轉(zhuǎn)化酶的變化

淀粉酶可將煙葉葉綠體中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，用來表征烤煙的碳代謝強弱。各處理的淀粉酶活性呈先上升后下降的趨勢。在移栽后60 d時達到最大值，其中N2的活性最大為19.98 mg·g-1·min-1。與CK相比，N0增施生物炭在烤煙整個生育期內(nèi)提高了煙葉淀粉酶活性，說明生物炭可以促進烤煙碳代謝。而增施氮肥雖然也可以提高煙葉淀粉酶活性，但并未表現(xiàn)出隨施氮量的增加而增加的規(guī)律性。

轉(zhuǎn)化酶可以催化細胞質(zhì)中的蔗糖轉(zhuǎn)化，形成葡萄糖和果糖的混合物，加強植物的光合作用中碳固定過程。各處理轉(zhuǎn)化酶活性呈先上升后下降的趨勢。在移栽后60 d時達到最大值，且N1的活性在數(shù)值上較高為3.90 mg·g-1·h-1，但除CK外，其他處理間差異不顯著；各處理在移栽后90 d時轉(zhuǎn)化酶活性迅速降低，而N3的活性降低幅度較小。與CK相比，N0增施生物炭可以顯著提高移栽后30 d時煙葉轉(zhuǎn)化酶活性，說明生物炭可以促進烤煙生育前期碳代謝。不同氮肥的處理(N1、N2、N3)也可以提高移栽后30 d時煙葉轉(zhuǎn)化酶活性，且在移栽后90 d時仍有效果，其中以N3表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

2.3 對煙葉氮磷鉀含量的影響

圖2顯示，各處理煙葉氮含量隨移栽后時間推移呈逐漸下降趨勢，在移栽后30 d時含量最高，各處理間差異不顯著。與CK相比，N0增施生物炭在移栽后60 d時可以顯著提高煙葉氮含量，而其他增施氮肥的處理的煙葉氮含量只在移栽后90 d時顯著高于CK，這可能是因為增施氮肥的處理煙葉干物質(zhì)量過大導致的。

圖2 不同處理移栽后不同天數(shù)烤煙煙葉的氮、磷、鉀含量

磷作為植物三大營養(yǎng)元素之一，能夠影響煙草的能量、碳水化合物和氮代謝等。各處理煙葉磷含量隨移栽后時間推移呈下降趨勢，在移栽后30 d時含量最高，且N1的煙葉磷含量最大為2.91%。在移栽后60 d和90 d時，與CK相比，其他增施生物炭與氮肥對煙葉磷含量并無顯著影響。

煙草是喜鉀作物，對鉀的吸收和積累最多。各處理煙葉鉀含量隨煙草生長呈下降趨勢，在移栽后30 d時煙葉鉀含量最高，除N1處理外其他處理間差異不顯著。與CK相比，N0增施生物炭在烤煙整個生育期內(nèi)對煙葉鉀含量并無顯著影響，而增施氮肥的處理的煙葉鉀含量在移栽后60 d時顯著低于CK，但在移栽后90 d時又顯著高于CK，這可能是因為烤煙在移栽后60 d時干物質(zhì)量迅速增加造成的稀釋作用導致在該時期煙葉鉀含量低于CK，但在移栽后90 d時，煙葉生長速度減緩，所以在該時期煙葉鉀含量又高于CK。

2.4 對烤后煙葉常規(guī)化學成分的影響

根據(jù)我國優(yōu)質(zhì)烤煙化學成分的適宜含量范圍，總糖含量一般為18%～22%，還原糖含量為16%～20%，煙堿含量為1.5%～3.5%，鉀含量大于2.0%等[25]。從表2可以看出，與CK相比，N0增施生物炭對烤后上部煙葉的常規(guī)化學成分的含量并無顯著影響，但提高了煙葉的鉀氯比，而增施氮肥的處理(N1、N2、N3)中N3顯著提高了煙葉總糖、還原糖、煙堿的含量，并且，增施氮肥可以降低煙葉氯的含量，N2、N3的糖堿比和鉀氯比較高。與CK相比，N0增施生物炭顯著提高了烤后中部煙葉的總糖、還原糖和鉀的含量，同時N0的糖堿比和鉀氯比也高于CK，但降低了煙堿和氯的含量。增施氮肥的處理中N1的總糖、還原糖的含量最高，N3煙葉鉀的含量最高，總體上增施氮肥可以提高煙葉總糖、還原糖、鉀、糖堿比和鉀氯比，且煙葉對氯的吸收隨施氮量的增加而降低。與CK相比，N0增施生物炭可以顯著降低烤后下部煙葉對總糖、還原糖、氯和鉀的積累，同時也降低了煙葉的糖堿比和鉀氯比，說明增施生物炭不利于烤煙下部葉對常規(guī)化學成分的吸收。而增施氮肥的處理中N3可以顯著提高煙葉總糖、還原糖、氯和鉀的含量，也提高了糖堿比與鉀氯比。N1、N2對下部葉吸收積累常規(guī)化學成分影響并不顯著?？傮w上來看，N3的烤后煙葉常規(guī)化學成分最接近優(yōu)質(zhì)煙葉標準。

2.5 對烤后煙葉致香物質(zhì)含量的影響

煙葉的香味是多種微量致香物質(zhì)共同作用的結(jié)果，因此，煙葉中的中性致香物質(zhì)是評定煙葉及其制品品質(zhì)的重要指標。張憲[26]、汪耀富等[27]將中性致香物質(zhì)分為類胡蘿卜素類、苯丙氨酸類、類西柏烷類、棕色化產(chǎn)物4大類。從表3可以看出，類胡蘿卜素類含量由大到小的順序為N3>N0>N2>N1>CK，N3含量最高為51.81 μg·g-1。與CK相比，N0增施生物炭可以顯著提高烤后煙葉中類胡蘿卜素類的含量，說明生物炭有利于煙葉中類胡蘿卜素類致香物質(zhì)的合成。而增施氮肥處理中N3的類胡蘿卜素類含量最高，說明提高氮肥施用量也有利于煙葉中合成類胡蘿卜素類致香物質(zhì)。苯丙氨酸類致香物質(zhì)對烤煙的果香和清香影響最大，與CK相比，N0增施生物炭提高了烤煙苯丙氨酸類致香物質(zhì)含量，其中N2的含量最高為33.57 μg·g-1，說明N2的施肥量最有利于烤煙苯丙氨酸類致香物質(zhì)的合成。類西柏烷類化合物是煙葉中豐富的致香物質(zhì)之一，能夠調(diào)和卷煙的吃味，各處理的類西柏烷類含量表現(xiàn)為N0>N3>N1>CK>N2，說明增施生物炭能夠顯著提高烤煙類西柏烷類致香物質(zhì)的合成，而在增施生物炭的基礎上增施氮肥對類西柏烷類化合物的合成有一定的抑制作用。棕色化反應產(chǎn)物影響著烤煙的可可香、堅果香、甜香等優(yōu)美香氣，與CK相比，增施生物炭與氮肥均可以顯著提高烤煙棕色化反應產(chǎn)物的含量，其中N0的含量最高為81.06 μg·g-1。新植二烯是烤煙含量最豐富的中性致香物質(zhì)，在烤煙燃燒時可以攜帶促進其他致香物質(zhì)進入煙氣，同時，還可以減輕煙氣的刺激性，提高煙氣的醇和度，與CK相比，N0的新植二烯含量最高為464.92 μg·g-1，說明增施生物炭促進了烤煙新植二烯的合成，而增施氮肥對烤煙合成新植二烯并無明顯的規(guī)律性，其中N2的含量甚至低于CK。各處理其他類致香物質(zhì)含量并無顯著差異。從致香物質(zhì)總量來看，增施生物炭與氮肥的處理的致香物質(zhì)總量均高于CK，其中以N0含量最高為616.29 μg·g-1，說明增施生物炭最有利于烤煙中性致香物質(zhì)的合成與積累。

表2 不同處理烤煙的常規(guī)化學成分

表3 不同處理烤后煙中部葉(C3F)的中性致香物質(zhì)含量 μg·g-1

3 討論

隨著化肥的施用，對烤煙生長及品質(zhì)造成的不良影響日益加劇，近年來，生物炭對烤煙的影響逐漸被人們所關注，相關的研究報道也較多。就烤煙相關農(nóng)藝性狀來說，宋久洋等[28]研究表明，添加生物炭后，煙草的株高、葉面積、葉片數(shù)、莖圍等指標與對照差異并不顯著；然而也有研究表明盆栽試驗增施生物炭可以顯著提高烤煙的農(nóng)藝性狀[29]；萬海濤[8]則通過大田試驗表明生物炭在烤煙移栽后60 d前對烤煙農(nóng)藝性狀有抑制作用。施氮量對烤煙農(nóng)藝形狀影響顯著，烤煙葉面積隨施氮量的增加而增加[30]，師進霖等[31]研究也表明，烤煙的最大葉面積、株高隨施氮量的增加呈增加趨勢。本試驗結(jié)果表明，增施生物炭對烤煙農(nóng)藝性狀并無顯著影響，增施氮肥則可以顯著促進烤煙的生長發(fā)育，這與宋久洋研究結(jié)果相似，這可能是由盆栽試驗與大田試驗中烤煙生長環(huán)境的差異造成的結(jié)果。

碳氮代謝作為烤煙體內(nèi)最重要的代謝，生物炭對其相關代謝酶類活性也有直接影響。在相同C/N比條件下，施用生物炭可以顯著提高煙葉碳氮關鍵酶活性[29]。也有研究表明，過量生物炭的施入會促使土壤中微生物繁殖與烤煙爭氮，從而導致沒有顯著提高烤煙酶活性[11]。王冠等[10]研究表明煙葉硝酸還原酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶的活性隨施氮量的增加而升高。趙春華[32]在盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)烤煙硝酸還原酶活性也隨施氮量的增加而升高。李雪利等研究也發(fā)現(xiàn)土壤碳氮比增加到一定程度時會降低烤煙淀粉酶活性，土壤碳氮比在24～28之間最有利于碳氮代謝的協(xié)調(diào)及煙葉品質(zhì)的提升[33-34]。本試驗結(jié)果表明，增施生物炭可以顯著促進烤煙碳氮代謝關鍵酶活性，與前人研究結(jié)果一致；而增施氮肥雖然也提高烤煙酶活性，但并未表現(xiàn)出烤煙酶活性隨施氮量的增加而升高的趨勢，在移栽后60 d時增施氮肥量最高的N3的淀粉酶活性反而低于低氮肥處理，這可能是因為高氮肥施用影響的土壤碳氮比導致降低了烤煙淀粉酶活性，這與李雪利等[33-34]的研究結(jié)果相似。

烤煙碳氮代謝酶活性的變化，與其煙葉中相關化學組成含量變化相互影響。有研究表明增施生物炭可以顯著提高煙葉中氮磷鉀的含量[29]。毛家偉等[17]研究不同生物炭肥水平后發(fā)現(xiàn)，施用碳肥能夠提高前期煙葉氮磷鉀的含量。管恩娜等[35]研究也表明生物炭可以促進烤煙生長過程中對鉀元素的吸收。有研究表明，煙葉氮含量會隨著施氮量的增加而增加，而煙葉磷鉀含量則在施氮量達到一定程度后隨之降低[36]；周柳強等[37]研究也表明增施氮肥可以提高煙葉對氮磷鉀的吸收量，但過高的施氮量對磷的吸收有一定的抑制作用。本試驗結(jié)果表明，增施生物炭只顯著影響煙葉氮含量，對磷鉀的吸收積累并無顯著影響，而增施氮肥對煙葉氮鉀含量的影響主要表現(xiàn)在移栽后90 d時，這可能是因為對照煙葉干物質(zhì)量與其他處理差異太大導致的。

生物炭對烤煙化學成分及中性致香物質(zhì)含量有顯著影響。從化學成分來看，張嘉煒等[38]發(fā)現(xiàn)，生物炭可以提高烤后煙葉煙堿含量。鄭加玉等[39]在皖南煙區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，生物炭在一定程度上降低了煙葉總糖及還原糖含量，提高煙堿及鉀含量。常規(guī)施肥配施生物炭可以使烤后煙葉的化學成分更接近優(yōu)質(zhì)煙葉的適宜范圍[40]。劉卉等[41]研究表明，合理配施生物炭與氮肥能夠改善煙葉的糖堿比、鉀氯比，使之趨近于適宜值。易鎮(zhèn)邪等[42]在湖南煙區(qū)研究表明，煙葉中總糖、還原糖含量隨施氮量的增加而下降，鉀和煙堿含量隨施氮量的增加而增加。本試驗結(jié)果表明，生物炭能夠提高上部煙葉鉀氯比以及中部煙葉總糖、還原糖、鉀、糖堿比和鉀氯比。而增施氮肥處理中N3施氮水平對烤煙化學成分的調(diào)控效果最優(yōu)。從中性致香物質(zhì)來看，有研究表明，生物炭提高了烤煙中性致香物質(zhì)總量[43-44]；王晶等[45]在撫州煙區(qū)的研究也發(fā)現(xiàn)生物炭能夠提高烤煙類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、新植二烯含量及中性致香物質(zhì)總量。施氮量對烤煙中性致香物質(zhì)組分和含量有一定的影響[46]，隨著施氮量增加，烤煙中性致香物質(zhì)的總量呈先升高后降低趨勢，過高的施氮量也會抑制烤煙中性致香物質(zhì)的合成[47]。本試驗結(jié)果表明，增施生物炭可以顯著提高烤煙中性致香物質(zhì)總量，這與張園營等[43]前人研究結(jié)果相似，而增施氮肥對烤煙生長及品質(zhì)的調(diào)控主要表現(xiàn)在農(nóng)藝性狀、烤后煙葉化學成分及中性致香物質(zhì)上，在豫中煙區(qū)以生物炭配施氮肥67.5 kg·hm-2施肥措施烤煙品質(zhì)最佳。

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