林亮亮

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福清 350119)

琯溪三紅蜜柚系蕓香科柑橘屬柚類優(yōu)良品種之一，是福建省平和縣地方傳統(tǒng)名果琯溪蜜柚的芽變株中最新選育的優(yōu)良品種，2012年獲得福建省品種審定委員會(huì)認(rèn)證推廣。三紅蜜柚果肉紅艷，晶瑩透亮，果皮海綿層呈粉色，外果皮黃里透紅，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，其柚果果型倒卵圓形，汁胞紅色，富含番茄紅素和β-胡蘿卜素，果汁豐實(shí)，甜酸適口，品質(zhì)極佳，比普通品種琯溪蜜柚、紅肉蜜柚早熟10～15 d，且皮薄少籽，柚果可食率高達(dá)70%，有良好的發(fā)展前景與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[1]。目前，三紅蜜柚主要采用嫁接和實(shí)生苗等繁殖方法，生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)，對(duì)操作技術(shù)要求較高，限制了優(yōu)良新品種的迅速推廣。

近年來(lái)，關(guān)于果樹(shù)體細(xì)胞胚胎再生體系的研究越來(lái)越多，并已在蘋果、核桃、枇杷、葡萄、荔枝等樹(shù)種上成功獲得體細(xì)胞胚胎[2]。植物體細(xì)胞胚胎的發(fā)生、發(fā)育與合子胚相似，是離體培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的有效途徑之一[3]。胚狀體的培養(yǎng)材料可采用植物的各種器官、組織做為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，甚至在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中都有可能形成體細(xì)胞胚胎，在取材方面比較方便多樣；同時(shí)，胚狀體的培養(yǎng)能將植物的無(wú)性繁殖從田間移至室內(nèi)，縮短植物繁殖時(shí)間，使育苗工廠化，從而避免傳統(tǒng)繁殖方式受生產(chǎn)季節(jié)及技術(shù)等瓶頸的影響。因此，運(yùn)用細(xì)胞工程中的體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行植物組培快繁，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因型統(tǒng)一、表現(xiàn)型優(yōu)良的一致性群體，能夠周年生產(chǎn)不受季節(jié)與地理位置的限制，在快速繁殖苗木、制作人工種子及基因工程研究等方面具有較大應(yīng)用潛力。

本研究采用三紅蜜柚無(wú)菌苗中的莖段為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織形成，進(jìn)一步分化形成體細(xì)胞胚胎，探討不同培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)三紅蜜柚胚性愈傷組織以及體細(xì)胞胚胎形成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，逐步建立起三紅蜜柚體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的組培快繁技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)自福清市惠煌農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司三紅蜜柚綠色生產(chǎn)基地，并由福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培中心利用三紅蜜柚種胚培育出的無(wú)菌苗，經(jīng)增殖形成的叢生苗中選取。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

試驗(yàn)采用株高4～5 cm，帶4～6片真葉的三紅蜜柚無(wú)菌苗為材料，因?yàn)椴牧媳旧頍o(wú)菌，無(wú)需再進(jìn)行消毒處理，直接在超凈工作臺(tái)上將其莖段截成長(zhǎng)0.5～1 cm的小段，每段帶1～2個(gè)莖節(jié)，作為誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的外植體。

1.2.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用MS、B5和改良WPM為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同培養(yǎng)階段添加不同濃度與配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(2，4-D、6-BA和NAA)，所有培養(yǎng)基添加瓊脂7 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值5.6，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻凝固后使用，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，胚性愈傷組織誘導(dǎo)的光照強(qiáng)度為500～1 000 lx，胚狀體萌發(fā)的光照強(qiáng)度為1 000～1 500 lx，壯苗與生根培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.3 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L9(34)，研究基本培養(yǎng)基(MS、B5、改良WPM)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D(0.5、1、1.5 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1) 對(duì)三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。將莖段接種到不同培養(yǎng)基上，每處理接種30瓶，每瓶接1個(gè)莖段，重復(fù)3次。

1.2.4 胚狀體的誘導(dǎo)

試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L9(34)，研究基本培養(yǎng)基(MS、B5、改良WPM)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.1、0.5 mg·L-1)對(duì)三紅蜜柚胚狀體發(fā)生率的影響。從誘導(dǎo)培養(yǎng)的三紅蜜柚胚性愈傷組織中選取出淡黃色、顆粒狀較明顯的愈傷組織塊，接種到不同的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每處理接種10瓶，每瓶接3塊，重復(fù)3次。

1.2.5 芽增殖

當(dāng)三紅蜜柚胚狀體上萌發(fā)出的小苗長(zhǎng)度達(dá)到2～3 cm時(shí)，將其從基部切下，接種于MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中進(jìn)行莖芽增殖，培養(yǎng)30 d左右，選取生長(zhǎng)健壯的小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.6 生根及移栽

選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)根小苗移到1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，將生長(zhǎng)健壯、具有7片以上真葉的生根苗逐步過(guò)渡到自然環(huán)境條件下進(jìn)行栽培。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)；

胚狀體誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)[4]。

正交試驗(yàn)結(jié)果采用DPS軟件的正交試驗(yàn)方差分析，方差分析的差異顯著性用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行平均數(shù)的多重比較[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三紅蜜柚體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、分化與植株再生

試驗(yàn)從已建立的三紅蜜柚組培快繁體系中獲得的無(wú)菌苗莖段為外植體，豎直接種在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的培養(yǎng)基上，30 d后莖段上端的切口處以及與培養(yǎng)基接觸的莖段基部逐步出現(xiàn)淡黃色、顆粒感較強(qiáng)的愈傷組織團(tuán)塊，將其轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25 d后這種淡黃色的愈傷組織能進(jìn)一步形成胚狀體并萌發(fā)產(chǎn)生不定芽，通過(guò)繼代培養(yǎng)生成三紅蜜柚小苗。

2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

三紅蜜柚無(wú)菌苗中獲得莖段作為外植體，經(jīng)過(guò)胚性愈傷組織培養(yǎng)基的誘導(dǎo)，莖段細(xì)胞分裂形成胚性愈傷組織，并不斷增殖，30 d后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。由表1可知，通過(guò)對(duì)各處理因子不同水平的SSR檢驗(yàn)，基本培養(yǎng)基對(duì)三紅蜜柚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達(dá)到極顯著水平，MS、B5、改良WPM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率均值分別為48.2%、19.3%、4.8%，誘導(dǎo)效果以MS培養(yǎng)基為最好；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D、6-BA不同水平對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，2,4-D濃度1.0和1.5 mg·L-1的誘導(dǎo)率均值分別為31.9%和11.9%，期間極差達(dá)20.0百分點(diǎn)；6-BA濃度0.5和1.0 mg·L-1的誘導(dǎo)率均值分別為29.6%和15.2%，其間極差達(dá)14.4百分點(diǎn)，均達(dá)到極顯著水平。因此，三紅蜜柚莖段胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組合為MS+2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1。

2.2 不同基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)胚狀體發(fā)生的影響

將誘導(dǎo)出的三紅蜜柚胚性愈傷組織細(xì)胞團(tuán)接種到體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以檢測(cè)愈傷組織的體胚發(fā)生能力[6]。

不同基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA)配比對(duì)胚狀體分化的影響見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)各處理因子不同水平的SSR檢驗(yàn)，基本培養(yǎng)基對(duì)胚狀體分化率的影響達(dá)到極顯著水平，以MS為最好，分化率均值達(dá)43.3%。在胚狀體分化期間，不同培養(yǎng)基添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比表現(xiàn)不同，NAA不同水平對(duì)胚狀體發(fā)生均表現(xiàn)有抑制作用，并隨著NAA濃度增強(qiáng)，達(dá)到極顯著水平；6-BA對(duì)胚狀體的發(fā)生產(chǎn)生一定影響，6-BA為0.1，1.0 mg·L-1的發(fā)生率均值分別為37.0%和14.5%，其間極差達(dá)22.4百分點(diǎn)，達(dá)到極顯著水平。試驗(yàn)結(jié)果還表明，添加0.1～0.5 mg·L-1的6-BA對(duì)胚狀體發(fā)生有促進(jìn)作用。因此，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg·L-1。

表1 不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果

表2 不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)效果及SSR檢驗(yàn)

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)針對(duì)三紅蜜柚體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)中的突出問(wèn)題，以篩選適宜誘導(dǎo)三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的培養(yǎng)基為目的，把優(yōu)化激素種類配比和濃度做為研究重點(diǎn)。試驗(yàn)采用前期培養(yǎng)的三紅蜜柚無(wú)菌苗莖段為外植體，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的研究手段，充分發(fā)揮其篩選最佳試驗(yàn)處理組合的捷徑功能，達(dá)到優(yōu)化培養(yǎng)基配方的目的。

已有研究表明，不同果樹(shù)種類對(duì)基本培養(yǎng)基的選擇也有物種特異性，必須對(duì)不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果進(jìn)行對(duì)比，篩選出適合誘導(dǎo)三紅蜜柚的體細(xì)胞胚胎生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，并進(jìn)一步獲得最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成。選用3種具有一定代表性的MS、B5和改良WPM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表明，MS的誘導(dǎo)效果最佳，B5次之，改良WPM最差，對(duì)這3種培養(yǎng)基的成分進(jìn)行分析，三紅蜜柚胚性愈傷組織與胚狀體的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀況與培養(yǎng)基中銨態(tài)氮及充足的鐵離子供給有關(guān)。

甜橙馴化愈傷組織生長(zhǎng)素對(duì)胚胎發(fā)生了重要作用[7]。Rao等[8]研究結(jié)果也表明2，4-D對(duì)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生起促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加2，4-D 1.0 mg·L-1及6-BA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性愈傷組織的效率最高，該類愈傷組織呈淡黃色，結(jié)構(gòu)緊實(shí)顆粒感強(qiáng)，而2，4-D濃度過(guò)高則會(huì)起到抑制作用，且易造成培養(yǎng)物褐變。在三紅蜜柚胚狀體誘導(dǎo)過(guò)程中，隨著NAA濃度升高胚狀體的發(fā)生率逐步降低，采用不添加NAA而單獨(dú)添加6-BA 0.1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生率最高。

試驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞工程中體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行三紅蜜柚體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)，建立三紅蜜柚優(yōu)良單株的體細(xì)胞胚胎再生體系，為三紅蜜柚優(yōu)良新群體的擴(kuò)繁與今后的基因工程研究奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)中還可進(jìn)一步對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子機(jī)理及生理生化機(jī)制進(jìn)行研究，把促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究成果在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行應(yīng)用。

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