殷雪妍,張 艾,劉亞男 (東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 201620)

糖皮質(zhì)激素(GC)是類固醇激素中重要的一類,包括氫化可的松、皮質(zhì)酮、可的松等,具有調(diào)節(jié)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用,被廣泛應(yīng)用于治療過(guò)敏、皮膚病、哮喘、關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病,是臨床應(yīng)用最多的藥物之一[1].GC主要通過(guò)人類和動(dòng)物的天然代謝排放以及醫(yī)院、制藥廠、飼料廠等廢水、廢渣排放進(jìn)入環(huán)境.當(dāng)這類物質(zhì)進(jìn)入水體環(huán)境時(shí),會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生潛在危害[2].研究表明,環(huán)境中皮質(zhì)激素的連續(xù)暴露導(dǎo)致某些地區(qū)魚類的免疫系統(tǒng)及生殖發(fā)育受到抑制和影響,這一毒性效應(yīng)甚至發(fā)生在環(huán)境濃度水平之下(ng/L級(jí))[3].因此GC的環(huán)境行為及其去除成為即環(huán)境雌激素和雄激素之后近年來(lái)國(guó)內(nèi)外環(huán)境激素研究的又一熱點(diǎn)問(wèn)題.

曲安奈德(TA),化學(xué)名為9-氟-11β,21-二羥基-16α,17-[(1-甲基亞乙基)雙(氧)]-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,是眾多GC中具有較高生物活性的一種,這種有鹵素化合成的GC是研究體外糖皮質(zhì)激素生物活性的重要環(huán)節(jié)[4].此外,TA最近被美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)用于非處方藥購(gòu)買[4],可預(yù)見(jiàn)今后TA的消耗量及排放量會(huì)進(jìn)一步增加.但目前對(duì)GC去除的研究非常少,對(duì)TA這種鹵代的強(qiáng)活性的GC去除的研究更少.

過(guò)氧化鈣(CaO2)是一種固體過(guò)氧化物,具有高能量的過(guò)氧化物共價(jià)鍵.在自然狀態(tài)下,CaO2溶于水可緩慢釋放出過(guò)氧化氫,避免了過(guò)氧化氫分解為氧氣產(chǎn)生的浪費(fèi).與傳統(tǒng)的高級(jí)氧化技術(shù)相比,CaO2氧化具有氧化效果穩(wěn)定持續(xù)、藥劑及運(yùn)行維護(hù)成本低、安全性高、對(duì)環(huán)境條件要求低、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是一種頗具前途的氧化技術(shù)[5].

CaO2對(duì)污染物的去除效率會(huì)受到反應(yīng)條件等因素的影響.通常的實(shí)驗(yàn)方法往往采用單因素變化法,忽略了不同因素之間的相互作用,從而不能夠?qū)χ餍?yīng)因素和相互作用進(jìn)行精確估計(jì).響應(yīng)面分析法(RSM)是優(yōu)化分析多因素對(duì)響應(yīng)值影響的一種方法[6-7],該方法可以根據(jù)因素設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)使用最少的實(shí)驗(yàn)數(shù)考察多個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響以及因素之間的交互關(guān)系[8],并且能夠優(yōu)化反應(yīng)條件并預(yù)測(cè)反應(yīng)結(jié)果,因此在化學(xué)、生物、食品科學(xué)及工業(yè)領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用[9-13].

本研究考察CaO2去除TA的反應(yīng)過(guò)程及效果,采用RSM分析結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)估反應(yīng)條件(CaO2投加量、溶液初始pH值、反應(yīng)時(shí)間、TA初始濃度)對(duì)CaO2去除TA的相互作用及影響; 通過(guò)Design Expert軟件建立響應(yīng)面多項(xiàng)式模型,優(yōu)化反應(yīng)條件,預(yù)測(cè)去除效果;結(jié)合電子順磁共振(EPR)對(duì)CaO2降解有機(jī)物過(guò)程中的作用自由基進(jìn)行檢測(cè),為CaO2降解有機(jī)污染物的技術(shù)發(fā)展提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥劑

TA(CAS:76-25-52)標(biāo)準(zhǔn)品,純度大于98%,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich.標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中配制成母液(1g/L),并貯存在4℃的環(huán)境中.分析級(jí)CaO2(CAS: 1305-79-9,75% CaO2,25% Ca(OH)2)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.所有的有機(jī)試劑,包括甲醇、乙腈,均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich,為高效液相色譜(HPLC)純.試驗(yàn)中所用的超純水取自Milli-Q超純水機(jī)(25℃下電阻率高于18.2MΩ).試驗(yàn)用到的其他試劑均為分析純,購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

CaO2氧化試驗(yàn)在250mL的棕色玻璃瓶中進(jìn)行,室溫下磁力攪拌.200mL內(nèi)含TA污染物的水樣轉(zhuǎn)移到燒杯中,用氫氧化鈉(1mmol/L)和硫酸(0.5mmol/L)調(diào)節(jié)溶液初始pH值,然后加入一定量的CaO2,按照預(yù)定的反應(yīng)時(shí)間加入0.2mL叔丁醇終止反應(yīng).每組水樣做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取平均值,標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%.

1.3 樣品分析方法

水樣經(jīng)過(guò)0.22μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾,將不溶物質(zhì)去除,采用固相萃取法濃縮水樣中的TA.固相萃取小柱為Oasis Hydrophilic-Lipophilic Balance (HLB,200mg/6cc)小柱.萃取過(guò)程參考Jia等[4]發(fā)表的方法.固相萃取的洗脫液在微氮?dú)饬飨碌抵两?再用甲醇定容至1mL.同時(shí)用蒸餾水做空白.然后利用高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè).

HPLC型號(hào)為Agilent 2000,USA.色譜柱為反相C-18柱(4.6mm×250mm,5μm,Agilent,USA),流動(dòng)相為乙腈/水(A/B,體積比),流動(dòng)相流速1mL/min,進(jìn)樣量50μL,柱溫40℃.采用紫外檢測(cè),波長(zhǎng)240nm,流動(dòng)相配比為初始條件72% B,保持3min,然后在1min內(nèi)直線下降至40% B,再在4min內(nèi)直線降至30% B,在0.5min內(nèi)直線降至0% B,保持1.5min.TA出峰時(shí)間為6.2～6.3min.方法的檢測(cè)限為0.171μmol/L.回收率為85%～94%.

1.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 實(shí)驗(yàn)自變量因素的實(shí)驗(yàn)范圍及水平分布Table 1 Experimental range and levels of independent process variables

本實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-expert的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)了4因素3水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的方案,4個(gè)因素為CaO2投加量、溶液初始pH值、反應(yīng)時(shí)間和污染物初始濃度,分別以A、B、C、D表示,3水平使用-1、0、+1進(jìn)行編碼,分別代表低、中、高3種水平,TA去除率為響應(yīng)值(R),設(shè)計(jì)因素的具體變化范圍與水平分布如表1所示.

1.5 EPR分析

將5μL磷酸鹽緩沖溶液(50mmol/L,pH=7.4)和5μL 電子捕獲劑(DMPO,0.9mol/L)加入到10μL的CaO2溶液(1g/L)中,將混合液放入石英毛細(xì)管中直接檢測(cè)它們的電子順磁共振性質(zhì).

采用德國(guó)Bruker公司的ER200D-SRC型電子順磁共振儀(EPR)對(duì)氧自由基進(jìn)行檢測(cè).樣品測(cè)試條件為:微波功率為6.4mW;調(diào)制幅度為1G;調(diào)制頻率為100kHz;測(cè)試溫度為290K;中心場(chǎng)為520G; 掃描寬度為100G;微波頻率為9.87GHz;接收機(jī)增益為5.64×104;除接收機(jī)增益外,其他儀器參數(shù)保持不變.

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面模型建立

利用Design-expert軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排,實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)測(cè)值和模型計(jì)算的預(yù)測(cè)值如表2所示.

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design matrix and response

續(xù)表2

2.2 模型分析

2.2.1 模型回歸分析 利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各影響因素(A為CaO2投加量(g/L),B為初始pH值, C為反應(yīng)時(shí)間(min),D為TA初始濃度(mmol/L))進(jìn)行處理,通過(guò)回歸分析,得出TA去除率(Y,%)與這4個(gè)因素之間較符合二次多項(xiàng)式關(guān)系,預(yù)測(cè)公式如下:

式中:正項(xiàng)系數(shù)代表該因素值增加會(huì)提高響應(yīng)值;負(fù)項(xiàng)系數(shù)代表該因素值增加會(huì)降低響應(yīng)值[14].

2.2.2 模型方差分析 模型方差分析(ANOVA)是通過(guò)運(yùn)用數(shù)學(xué)分析工具細(xì)化所有變量與響應(yīng)值的關(guān)系,從而考察模型假設(shè)參數(shù)是否準(zhǔn)確.本研究中模型的方差分析結(jié)果如表3所示.

其中模型F值(125.83)足夠大,表明預(yù)測(cè)公式可以準(zhǔn)確的反映變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系; 4個(gè)因素的P值均小于0.0001,表明這4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響極為顯著; AB、AC、BC的P值均小于0.0001,表明其兩兩因素的交互作用顯著,而AD、BD和CD的P值較大,說(shuō)明其兩兩因素的交互作用相對(duì)較小.

此外,決定系數(shù)R2是判斷回歸方程有效性的一個(gè)重要參數(shù).R2值越接近1,表明經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍苡行У胤从硨?shí)驗(yàn)結(jié)果.本回歸模型R2為0.9921,這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)測(cè)定值與模型預(yù)測(cè)值相關(guān)性很高;精度比用來(lái)衡量有效數(shù)據(jù)和干擾之間的比例關(guān)系,通常認(rèn)為大于4是理想的[15-16],本模型的精確度為33.864,說(shuō)明有效數(shù)據(jù)充分,模型可靠,能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)響應(yīng)值.

表3 模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance (ANOVA) variables fitted to quadratic polynomial models

2.2.3 模型殘差分析 殘差是指實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的差值,通過(guò)殘差分析可以分析數(shù)據(jù)的可靠性或干擾,從而說(shuō)明模型的可靠性[17]以及響應(yīng)面是否符合方差分析的假設(shè)條件[18].因此除了上述回歸參數(shù)的考察,本研究還對(duì)模型進(jìn)行了殘差分析,結(jié)果如圖1所示.

圖1為殘差正態(tài)概率分布示意圖.正態(tài)概率分布用來(lái)說(shuō)明模型殘差是否服從高斯正態(tài)分布,內(nèi)部學(xué)生化殘差用來(lái)表征標(biāo)準(zhǔn)偏差偏離實(shí)際、預(yù)測(cè)響應(yīng)值的程度,在圖形上表現(xiàn)為數(shù)據(jù)點(diǎn)是否基本呈線性分布[19].可以看出,響應(yīng)值基本都附著在殘差線上,說(shuō)明模型符合正態(tài)分布.內(nèi)部、外部學(xué)生化殘差均分布在±3.50范圍之內(nèi),說(shuō)明不存在非正常數(shù)據(jù),無(wú)隱藏的影響響應(yīng)面的因素[20],且數(shù)據(jù)點(diǎn)隨機(jī)分布,沒(méi)有任何趨勢(shì),也沒(méi)有異常點(diǎn),進(jìn)一步說(shuō)明了模型的可靠性.因此,響應(yīng)面多項(xiàng)式模型具有高度顯著性,能夠有效模擬CaO2去除糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)情況.

圖1 模型殘差整體概率分布示意Fig.1 Normal probability plot of the model residuals

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面是描述各個(gè)因素對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值的三維曲面圖,從響應(yīng)面可以看出各個(gè)因素之間的相互作用關(guān)系.為了更直觀地說(shuō)明CaO2投加量、溶液初始pH值、反應(yīng)時(shí)間及TA初始濃度對(duì)CaO2去除水中TA效果的影響,利用design expert軟件繪出兩兩自變量為坐標(biāo)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖,如圖2～圖4所示.通常橢圓形或者馬鞍形的等高線說(shuō)明兩個(gè)因素之間具有明顯的交互作用[21].

圖2 CaO2投加量與溶液初始pH值對(duì)TA降解率影響Fig.2 TA removal efficiencies at different CaO2 dosage and initial pH

如圖2所示,CaO2投加量與溶液初始pH值所對(duì)應(yīng)的等高線圖成橢圓形,表明二者交互作用明顯[21].從響應(yīng)曲面圖可以看出,當(dāng)初始pH值一定時(shí),CaO2投加量在0.05～4g/L的范圍內(nèi),TA的去除率是先上升后趨于穩(wěn)定;這是因?yàn)殡S著CaO2投加量的增多,釋放的H2O2及其他活性氧自由基的濃度也會(huì)升高,從而促進(jìn)了污染物的降解去除.

而當(dāng)CaO2投加量固定時(shí),隨著溶液初始pH值的增加,TA的去除率則先升高后降低,在中性條件下取得最大值;分析其原因?yàn)?在CaO2氧化過(guò)程中,pH值會(huì)影響H2O2的產(chǎn)生效率[5].在酸性條件下,CaO2會(huì)迅速溶解釋放大量H2O2(式(1)),造成過(guò)量的H2O2發(fā)生分解(式(2)),從而導(dǎo)致TA的去除率降低;在堿性條件下,隨著pH值的升高,CaO2釋放的H2O2量會(huì)降低.在pH值低于10時(shí),CaO2能較好的釋放H2O2并且H2O2分解為氧氣的量也較少.一旦pH值超過(guò)11,CaO2就很難溶解產(chǎn)生H2O2,而是形成氫氧化鈣和氧氣(公式(3)),從而導(dǎo)致TA的去除率降低[22].其中,最大響應(yīng)值在pH值接近中性時(shí)取得,這表明CaO2氧化技術(shù)在中性條件下即可得到良好的污染物去除效果,與傳統(tǒng)的Fenton氧化需要將溶液pH值調(diào)至酸性相比,大大節(jié)約了處理成本,是CaO2氧化技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì).Northup等[5]的研究也發(fā)現(xiàn),CaO2在pH值為6～9時(shí)比液態(tài)H2O2更能有效的去除四氯乙烯.Qian等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)CaO2在pH值為5～9時(shí)能有效去除甲苯,在pH值為6時(shí)甲苯去除率達(dá)到最大.

圖3 CaO2投加量與反應(yīng)時(shí)間對(duì)TA降解率影響Fig.3 TA removal efficiencies at different CaO2 dosage and time

圖3顯示了CaO2投加量與反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)因素的交互影響情況.兩個(gè)因素相對(duì)應(yīng)的等高線圖呈橢圓形,表明二者交互作用明顯[19].從響應(yīng)曲面圖可以看出,響應(yīng)值隨CaO2投加量和反應(yīng)時(shí)間的增加而增加,并且響應(yīng)值在CaO2投加量較小、反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)變化較大,曲面斜率明顯; 隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)和CaO2投加量的增多,響應(yīng)值增長(zhǎng)變緩,曲面變平.這說(shuō)明反應(yīng)剛開始時(shí)目標(biāo)物降解速率較快,分析原因可能為反應(yīng)剛開始時(shí)目標(biāo)物濃度較高,更易與CaO2產(chǎn)生的H2O2反應(yīng)[24].

圖4 CaO2投加量與TA初始濃度對(duì)降解率影響Fig.4 TA removal efficiencies at different CaO2 dosage and TA concentration

本課題組前期研究[22]發(fā)現(xiàn)CaO2能有效去除水中的酚類內(nèi)分泌干擾物(包括雌酮、雌二醇、雌三醇、乙炔雌二醇、雙酚A及壬基酚),但在初始pH值為7、CaO2投加量為0.1g/L時(shí)去除80 %的酚類內(nèi)分泌干擾物需要7d[22].而在本研究中,在初始pH值為7、CaO2投加量為0.1g/L時(shí)去除80 %的糖皮質(zhì)激素類污染物僅需要18min.因此,與酚類內(nèi)分泌干擾物相比,CaO2能更高效的去除糖皮質(zhì)激素類污染物.

圖4顯示了CaO2投加量與TA初始濃度兩個(gè)因素的交互影響情況.相應(yīng)的等高線圖呈橢圓形,表明二者交互作用明顯[21].從響應(yīng)曲面圖上可以看出,當(dāng)CaO2投加量固定時(shí),TA的去除率隨TA初始濃度的增加而增加,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了圖3所得結(jié)論.當(dāng)TA濃度較高時(shí),TA與CaO2產(chǎn)生的H2O2迅速反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)了CaO2溶解產(chǎn)生更多的H2O2,進(jìn)而促進(jìn)更多?OH等活性氧自由基的生成(H2O2→2?OH),從而導(dǎo)致TA去除率升高.當(dāng)TA初始濃度較低時(shí),隨著CaO2投加量的增加,響應(yīng)值先升高后趨于平緩并有降低趨勢(shì).其原因是當(dāng)TA濃度較低時(shí),CaO2投加量增多會(huì)使溶解產(chǎn)生的H2O2相對(duì)過(guò)量,當(dāng)H2O2濃度過(guò)高時(shí)會(huì)發(fā)生自分解現(xiàn)象(式(3)),并且多余的H2O2還會(huì)消耗?OH等活性氧自由基(H2O2+?OH→HO2?+ H2O),從而使目標(biāo)物去除率有所下降[24].因此存在某一最佳CaO2投加量使得糖皮質(zhì)激素污染物去除效果較好同時(shí)節(jié)省藥劑投加量并降低處理成本.

2.4 模型的優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)以上響應(yīng)曲面法分析,結(jié)合響應(yīng)面模型,利用Design-expert軟件模擬出較好效果的處理組為: CaO2投加量4g/L;溶液初始pH值5.7,初始TA濃度為0.06mmol/L,反應(yīng)時(shí)間15.7min,預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下TA去除率為88.6 %.為驗(yàn)證其結(jié)果,在此優(yōu)化條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,得到TA去除率實(shí)測(cè)值為82.8%,與預(yù)測(cè)值比較接近,這說(shuō)明響應(yīng)面模型具有一定可信度,能夠有效預(yù)測(cè)CaO2氧化去除水中糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)結(jié)果.

2.5 自由基檢測(cè)

為進(jìn)一步探索CaO2氧化去除水中糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)機(jī)理,研究采用EPR分析檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基.DMSO體系下產(chǎn)生的EPR信號(hào)如圖5所示:

圖5 水中CaO2氧化釋放自由基的電子順磁共振波譜Fig.5 EPR spectrum of radicals released by CaO2 with DMPO spin trap in water

在僅投加CaO2時(shí),由圖5測(cè)得EPR信號(hào)的異性因子g為2.005,四條分行線的高度比為1:2:2:1.上述參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的?OH的特征參數(shù)一致[25],表明CaO2去除糖皮質(zhì)激素過(guò)程中的主要作用自由基為羥基自由基.在含有糖皮質(zhì)激素的水樣中投加CaO2,得到的EPR信號(hào)由兩種順磁性離子組成: ?OH和?C-R自由基(圖5),這表明CaO2氧化過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)與糖皮質(zhì)激素反應(yīng),產(chǎn)生碳化合物自由基中間體(?C-R).碳化合物自由基被DMPO捕捉,形成更穩(wěn)定的加合物(DMPO+?C-R→?DMPO-C-R).根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23],得出CaO2活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生及與糖皮質(zhì)激素污染物反應(yīng)的機(jī)制如下所示:

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)響應(yīng)面分析得到描述CaO2降解水中TA各影響因素之間的響應(yīng)面模型,其中模型回歸系數(shù)R2=0.9921,說(shuō)明該響應(yīng)面模型能夠較好地模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

3.2 CaO2投加量與溶液初始pH值、反應(yīng)時(shí)間和污染物初始濃度之間均存在相互作用,必須考慮到其交互作用的影響.

3.3 基于響應(yīng)面模型對(duì)CaO2降解水中TA反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳反應(yīng)條件為: CaO2投加量4g/L;溶液初始pH值5.7,初始TA濃度為0.06mmol/L,反應(yīng)時(shí)間15.7min,預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下TA去除率為88.6%,經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證獲得的最大去除率為82.8%,數(shù)值接近,說(shuō)明響應(yīng)面模型能夠有效優(yōu)化CaO2降解水中糖皮質(zhì)激素的試驗(yàn)條件,預(yù)測(cè)其試驗(yàn)結(jié)果,為CaO2降解糖皮質(zhì)激素技術(shù)提供技術(shù)參考.

3.4 CaO2去除糖皮質(zhì)激素過(guò)程中的主要作用自由基為羥基自由基,其作用機(jī)制為CaO2溶于水產(chǎn)生H2O2,H2O2氧化過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)與糖皮質(zhì)激素反應(yīng),產(chǎn)生碳化合物自由基中間體(?C-R),進(jìn)一步氧化去除.

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