黃益娜，吳濤，劉銳，張民

（天津科技大學新農村發(fā)展研究院，食品生物技術教育部工程研究中心，天津科技大學食品生物技術與食品工程學院，天津 300457）

大蒜屬多草本植物，蘊含著大量的多功能硫化合物，具有廣譜抑菌、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、調節(jié)血糖和提高免疫等多種生物活性[1～6]，目前，對其研究大部分集中在大蒜素上，但是，由于大蒜素的不穩(wěn)定及其提取分離純化難度大，價格昂貴，導致其市場應用價值低，大蒜類生物醫(yī)藥制品等高端產品國內未見報道[7]。因此，工作者對其含硫化合物中S-S(S=O)鍵為母體進行了修飾合成、尋找合適的化合物成為當今研究的熱點。Hisae等通過比較大蒜素(Allicin)、S-甲基亞磺酸硫代丙烯酯(AllS(O)Sme)、Z,E-亞硫?；惐?AllS(O)SPn-(Z,E))得出AllS(O)SMe、AllS(O)SPn-(Z,E)均有明顯的抑菌作用，最小抑菌濃度（MIC值）分別為5 mg/mL、80 mg/mL、20 mg/mL，但是抑菌效果較大蒜素Allicin弱[8]。任方奎發(fā)現大蒜素的不同衍生物抑菌活性隨著結構的變化而改變，其中二(3-甲基-2-丁烯基)三硫醚比大蒜素效果好[9]。Jay等[10]通過比較不同含硫化物抑菌強弱表明：二烯丙基四硫化物>二乙基四硫化物>二甲基四硫化物>二烯丙基二硫化物>二乙基三硫化物>二甲基三硫化物>二丙基二硫化物>烯丙基二硫化物。這些研究表明了大蒜硫化合物中S-S(S=O)鍵是主要的抑菌結構，其抑菌活性大小受其基團結構的影響。

近年來計算機技術的迅速發(fā)展，通過統(tǒng)計學方法以及揭示活性和結構之間的關系變化，以數學模型或圖形概況來表征量變規(guī)律，從而避免大量人力物力和財力的浪費，使其在化學、藥物設計、農藥領域、醫(yī)藥領域和食品中的應用越來越廣泛。但是，利用計算機技術通過構效關系構建模型來設計大蒜衍生物未見報道。本論文是通過前期構建比較分子力場Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA)模型，以二烯丙基三硫化物（DATS）為母體來改造、設計一種新的化合物TSDB，其對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC值）為16 μg/mL，抑菌強度是DATS的3倍，很好的提高了抑菌活性，并測定了生長曲線、電導率、培養(yǎng)液中蛋白含量基礎上，采用蛋白質十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法、高效液相色譜測定有機酸變化、AnnexinV單染色法觀察細胞凋亡情況，重點研究了TSDB的抑菌機理，從而將TSDB開發(fā)成為抑菌劑提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

金黃色葡萄球菌，天津科技大學菌株保藏中心提供；95%三硫烷二丁烯酸（TSDB）、95%二烯丙基三硫化物（DATS），大連茵泰科技有限公司提供；NB營養(yǎng)肉湯，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白Marker，Takara Bio；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液等蛋白電泳相關試劑，北京索來寶科技有限公司；色譜純L-蘋果酸、L-乳酸、檸檬酸、草酸；磷酸二氫鉀；甲醇；冰乙酸；考馬斯亮藍；Tris；甘氨酸等其他的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相，日本島津公司；倒置熒光顯微，CKX41-FL；垂直蛋白質電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，北京六一儀器，高速小型臺式離心機，Thermo Fisher；無菌操作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

無菌操作條件下，將保藏中的菌種接種到肉湯（牛肉膏蛋白胨）培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復兩次。用接種環(huán)取活化后的菌液在斜面固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h。活化后的受試菌液于NB液體培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)8 h，調整細菌的終濃度約為105CFU/mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE電泳

參照文獻[11]，將細菌接種于6 mL NB營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數生長期后的菌液，實驗組中加入MIC濃度的TSDB和DATS，未處理組為對照組，于37 ℃培養(yǎng)10 h，以4300 r/min離心10 min，去上清液，加入少量無菌PBS（pH=7.4)洗三次，加入300 μL的10 mg/mL溶菌酶溶液，37 ℃下放置20 min，4 ℃、4300 r/min離心5 min，取上清液30 μL加入10 μL Buffer，振蕩，于100 ℃熱水浴中10 min，15 μL上樣進行SDS-PAGE電泳，染色、脫色、拍照觀察菌體蛋白表達情況。

1.3.3 有機酸測定

按照文獻[12]，取培養(yǎng)至對數生長期后的菌液，實驗組中加入MIC濃度的TSDB和DATS，未處理組為對照組，于37 ℃培養(yǎng)10 h，43000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后沸水浴10 min，取出后劇烈震蕩，并將其于10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔膜過濾后測定上清液中有機酸生成情況。

進樣體積：10 μL；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；流動相：0.1 mol/L KH2PO4溶液（超純水配制，pH 2.65）和乙腈，溶液比例采用程序梯度洗脫，流速0.5 mL/min。

1.3.4 AnnexinV細胞凋亡測試

將培養(yǎng)至對數生長期的菌液，調節(jié)菌體濃度大約為5×105CFU/mL，43000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞兩次，加入500 μL結合液，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，隨后滴一滴上述細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞，于熒光顯微鏡下檢測。

1.4 統(tǒng)計分析結果

所有試驗重復三次，結果以X±SD（平均值±標準偏差）表示。采用SPSS 19.0對試驗數據進行方差分析，差異顯著采用Duncan法進行比較，p<0.05即認為存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 TSDB和DATS對蛋白質合成的影響

TSDB和DATS對金黃色葡萄球菌胞內蛋白合成的影響如圖1所示?？梢钥闯觯簩φ战M和處理組菌株活性蛋白電泳條帶有較大的差異。主要表現為分子質量在44.3～200 ku之間的條帶變模糊或者消失，比較TSDB處理與DATS蛋白圖譜可知TSDB條帶明顯較DATS消失。

蛋白質圖譜可以反映出它的全部基因組，因此功能蛋白質的變化可以由凝膠電泳圖譜表現出來，其條帶深淺的改變、增加或缺失都表明蛋白表達量有所變化[13]。SDS-PAGE電泳蛋白條帶明顯改變的現象，說明了受試化合物TSDB和DATS可能影響了菌體蛋白的正常表達或影響了其功能，改變了細菌某些關鍵的結構或功能蛋白的合成。TSDB條帶明顯較DATS消失，可能是因為新化合物TSDB比DATS多了功能團-COOH，使其與蛋白受體結合更牢固或者接觸面積增大，從而加強了抑菌活性。Ankri等研究結果表明大蒜素主要抑菌機理是通過與巰基的化學作用（比如乙醇脫氫酶、硫氧還蛋白等還原酶和RNA聚合酶），從而影響半胱氨酸蛋白活性，抑制蛋白質合成來殺死細菌[14]。Saeed等人研究報道：蛋白質條帶模糊和消失會隨處理時間不同而不同，是由大蒜或其它植物提取物抑制了蛋白的合成、表達[15]。張緯等研究發(fā)現在檸檬提取物作用下，蛋白質條帶在分子量為14.4～43.0 ku之間缺失或變淺，表明檸檬提取物改變細菌蛋白組成和表達量[16]。

圖1 TSDB和DATS處理下金黃色葡萄球菌胞內蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of proteins extracted from S. aureus treated with TSDB and DATS

2.2 TSDB和DATS對有機酸代謝影響

圖2 TSDB和DATS對Saureus胞內有機酸代謝影響Fig.2 Organic acids in the cell-supernatants after treating with the TSDB and DATS

代謝是一切生命形式活動的基本特征，微生物在代謝過程中，會產生多種的代謝產物，如氨基酸、核苷酸、有機酸等[17]。其代謝產物會受外界環(huán)境的變化而不同。

由圖2中可知，實驗組中蘋果酸、草酸、檸檬酸和乳酸的含量相對于對照組明顯下降，其TSDB處理組金黃色葡萄球菌胞內草酸和乳酸未檢測到，而DATS組金黃色葡萄球菌胞內草酸含量下降至1.63 mg/L（降低了48.74%），是對照組的0.55倍；蘋果酸含量分別下降至5.49 mg/L和6.62 mg/L(減少了65.16%和57.99%)，呈顯著差異（p<0.05）。此外，TSDB組和DATS組檸檬酸含量分別減少至9.79 mg/L和12.32 mg/L（下降了56.18%、44.85%），表明TSDB處理組能夠改變金黃色葡萄球菌中有機酸代謝，其中對草酸和蘋果酸含量的影響強于DATS組。

金黃色葡萄球菌胞內有機酸含量明顯的減少，說明TSDB和DATS改變金黃色葡萄球菌的細胞代謝途徑。檸檬酸、蘋果酸是三羧酸循環(huán)中的代謝產物，其含量明顯的減少，說明TSDB和DATS有可能抑制三羧酸循環(huán)中檸檬酸合成酶等關鍵酶的活性，導致代謝無法正常進行[18,19]。同時，三羧酸循環(huán)中產生的蘋果酸可以脫酸生成丙酮酸，并進一步參與其它代謝途徑，由于TSDB和DATS處理使蘋果酸含量顯著降低，有可能導致中間代謝產物丙酮酸減少，進而對蛋白質、糖代謝造成一定影響。

2.3 TSDB和DATS對細胞凋亡的影響

AnnexinV是一種磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異結合而呈現。PS外翻發(fā)生在細胞核破裂，DNA片段化出現之前，這使得AnnexinV與PS的結合成為凋亡早期的一種重要檢測手段。TSDB和DATS處理后金黃色葡萄球菌細胞凋亡情況如圖3所示?？梢钥闯?，未經處理組圖中細胞膜表面呈蘋果綠色的圓點很少，而TSDB和DATS處理后細胞出現蘋果綠的圓點急劇增加，且TSDB組蘋果綠圓點比DATS組多，說明化合物TSDB和DATS處理使得細胞膜內磷脂酰絲氨酸外翻，細胞凋亡。

實驗結果間接說明，TSDB和DATS主要是破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜，其中TSDB對細胞膜的破壞效果要強于DATS，前期實驗室研究也表明大蒜降解產物主要是破壞大腸桿菌細胞膜，影響其內環(huán)境的改變，進而引起細胞凋亡[20]。研究報告大蒜素及其類似物對微生物的抑制機理一般為降解細胞壁，破壞細胞膜，內容物外漏，抑制蛋白質合成，導致細胞凋亡或壞死[21]。因此，細胞膜通透性增大，進而改變胞內外細胞正常代謝，最終導致細胞凋亡。

圖3 TSDB和DATS處理后細胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of cells treated with TSDB and DATS

3 結論

TSDB對金黃色葡萄球菌SDS-PAGE電泳結果表明，TSDB影響細菌蛋白質代謝，可能促進代謝過程中蛋白質的降解；有機酸代謝實驗發(fā)現，TSDB對金黃色葡萄球菌作用10 h后，胞內檸檬酸、草酸和蘋果酸含量明顯減少，表明此時的有機酸正常代謝受到影響；綜上可知，TSDB主要是破壞細胞膜，擾亂了細胞的正常代謝，破壞蛋白質合成、有機酸代謝，從而導致細胞凋亡。因此，這一研究的發(fā)現為TSDB成為一種新型食品防腐劑提供理論支持。

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