文│蔡洪波（遼寧省建平縣八家農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

為了解遼寧省朝陽(yáng)市豬流行性腹瀉的病原在季節(jié)及各個(gè)日齡的感染強(qiáng)度，分別采集34份血清和63份病料樣品，應(yīng)用RT-PCR和試紙條檢測(cè)方法對(duì)病料樣品和血清進(jìn)行病毒核酸和抗原檢測(cè)。結(jié)果顯示，豬流行性腹瀉在遼寧省朝陽(yáng)市的各個(gè)季節(jié)和各個(gè)日齡階段均有感染，但在氣候偏寒冷的冬季容易感染和發(fā)病，主要侵害30日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，其病毒核酸陽(yáng)性率高達(dá)71.4%，血清抗原陽(yáng)性率高達(dá)43.2%。因此，應(yīng)針對(duì)以上情況，對(duì)豬場(chǎng)全面采取免疫接種、消毒、環(huán)境營(yíng)養(yǎng)控制等生物安全管理措施，尤其是在寒冷季節(jié)針對(duì)哺乳仔豬進(jìn)行重點(diǎn)防控。

一、材料與方法

1.材料。

（1）檢測(cè)樣品。在遼寧省朝陽(yáng)市各大養(yǎng)殖豬場(chǎng)戶，分不同時(shí)間和不同日齡進(jìn)行全面隨機(jī)采集有腹瀉癥狀的豬糞便或發(fā)病死亡豬腸道樣品、血清。糞便和腸道內(nèi)容物樣品用于RTPCR病毒基因檢測(cè)，血清樣品用于金標(biāo)試紙病毒抗原檢測(cè)。上述樣品采集于發(fā)病流行期間，時(shí)間為2016年4月～2017年3月。

（2）試劑盒來(lái)源。豬流行性腹瀉病毒一步法RT-PCR診斷試劑盒，即為反轉(zhuǎn)錄酶（M_MLV）、RNA酶抑制劑由Promega公司生產(chǎn)。RT-PCR試劑（10×Buffer，d-NTP s，TaqDNA聚合酶等）均購(gòu)自TaKaRa公司。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。豬流行性腹瀉抗原檢測(cè)金標(biāo)試紙條由山東綠都生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為L(zhǎng)D-Z01。

（3）主要儀器和用品。儀器：PCR儀GT9612，鄭州市金水區(qū)南北儀器儀表商行；電泳儀JY1600C通用型，深圳市科昊實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

用品：包括金標(biāo)試紙條、洗板、槍頭、EP管、量筒、容量瓶、勻漿器、剪刀、鑷子等。

2.方法。

（2）RT-PCR檢測(cè)。將制成的模板RNA解凍或現(xiàn)用，引物、酶、dNTP、混合液ddH2O在室溫（15～25℃）解凍備用。

PCR反應(yīng)步驟：變性、退火和延伸。在PCR管中按順序添加5×Taq聚合酶buffer（包含引物）、dH2O、酶（Taq聚合酶 ）、dNTP、M2+加樣本模板對(duì)照DNA。

電泳鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

（3）金標(biāo)紙抗原檢測(cè)。豬流行性腹瀉病毒應(yīng)用豬流行性腹瀉抗原檢測(cè)金標(biāo)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

（4）豬場(chǎng)防控管理措施。根據(jù)豬流行性腹瀉的病原學(xué)調(diào)查結(jié)果，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)制定了嚴(yán)格生物安全管理措施，其中包括豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理制度、飼料營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境衛(wèi)生、無(wú)害化處理、消毒制度、生物藥物保健、免疫接種和疫病監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程。選擇朝陽(yáng)市建平縣華晨種豬場(chǎng)進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)。

表1 病料樣品采集份數(shù)

表2 血清樣品采集份數(shù)

（5）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

二、結(jié)果與分析

1.病料樣品、血清樣品采集數(shù)量。不同時(shí)間、日齡采集病料樣品、血清樣品份數(shù)見(jiàn)表1～2。

結(jié)合自己的“下水”心得和做題情境，我傾向于第三類同學(xué)的做法，因?yàn)橛械姆攀复_實(shí)可以讓閱讀的目光變得更敏銳，提筆標(biāo)畫(huà)更有方向性和側(cè)重點(diǎn)（其實(shí)關(guān)于不動(dòng)筆墨不讀書(shū)的道理不難懂，問(wèn)題是——非知之艱，惟行之艱），不會(huì)出現(xiàn)要么沒(méi)重點(diǎn)，要么處處是重點(diǎn)而變成沒(méi)重點(diǎn)，耗時(shí)耗力，答題效率低下。

2.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。63份豬流行性腹瀉病毒病料樣品在不同時(shí)間、日齡下RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。由表得知，易感豬群在1～30日齡偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，病毒核酸陽(yáng)性率為62.5%，2017年1～3月，病毒核酸陽(yáng)性率為71.4%，明顯高于其他兩個(gè)季度（P＜0.01）。

3.血清檢測(cè)結(jié)果。34份豬流行性腹瀉病毒血清樣品在不同時(shí)間、日齡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。由表得知，1～30日齡抗原陽(yáng)性率偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，抗原陽(yáng)性率為40.1%，2017年1～3月，抗原陽(yáng)性率為43.2%，高于其他季度時(shí)間（P＜0.01）。

三、討論

1.豬流行性腹瀉病毒主要感染情況。上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，豬流行性腹瀉病毒在遼寧省朝陽(yáng)市分布較為廣泛，在各季節(jié)均有感染，但1～3月感染率較高，說(shuō)明在氣候偏寒冷的季節(jié)感染率和發(fā)病率都很高。1月齡以內(nèi)的哺乳仔豬感染率和病死率最高，育肥豬和成年豬感染率較低，也容易恢復(fù)。豬流行性腹瀉抗原檢測(cè)金標(biāo)試紙條檢測(cè)結(jié)果和基因檢測(cè)結(jié)果一致，其操作簡(jiǎn)便、速度快、成本低，適合臨床應(yīng)用。

2.豬場(chǎng)流行性腹瀉疾病發(fā)生的誘因。根據(jù)對(duì)朝陽(yáng)市各大養(yǎng)殖豬場(chǎng)戶的豬病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析，說(shuō)明該病在豬場(chǎng)中污染嚴(yán)重，但是多發(fā)生在枯草期和寒冷時(shí)期。造成發(fā)病的誘因是季節(jié)，所以在制定防范措施的過(guò)程中，要注意保持豬圈干燥，避免潮濕陰冷，及時(shí)做好防護(hù)保護(hù)措施，還要定期檢測(cè)病原，制定相應(yīng)的免疫程序，達(dá)到最佳的防治措施。

3.應(yīng)用生物安全措施防治豬腹瀉性疾病。規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)養(yǎng)豬數(shù)量多，豬的調(diào)動(dòng)頻繁，飼料周轉(zhuǎn)快，所以人員車輛出入多。場(chǎng)內(nèi)一旦有該病原微生物感染，如防范管理措施不當(dāng)就會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且這種病原微生物不易被消滅，可能長(zhǎng)久危害豬場(chǎng)。因此，要制定完善的生物安全管理措施，并且嚴(yán)格執(zhí)行才能確保養(yǎng)豬場(chǎng)健康穩(wěn)定發(fā)展。

飼養(yǎng)管理是養(yǎng)殖場(chǎng)疫病防控的關(guān)鍵。首先，做好豬群飼料、飼喂、飲水的管理，使易感群具有抗病能力；其次，控制好豬群的調(diào)轉(zhuǎn)、車輛及人員的出入；第三，做好場(chǎng)舍的消毒、出入場(chǎng)豬的檢疫、豬舍的環(huán)境衛(wèi)生、舍內(nèi)的通風(fēng)、控制好溫度和濕度等工作；最后，定期進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，飼料中投中藥保健預(yù)防，針對(duì)性做好免疫接種。做好上述綜合生物安全管理措施才能有效防控傳染病的發(fā)生。

表3 養(yǎng)殖豬場(chǎng)病毒核酸檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率（%）

表4 養(yǎng)殖豬場(chǎng)血清抗原檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率（%）

4.豬流行性腹瀉的防治。豬流行性腹瀉病毒傳播較慢，發(fā)病后對(duì)易感豬群及時(shí)免疫，應(yīng)用豬胃腹二聯(lián)疫苗免疫注射，并且在每年的秋季開(kāi)始免疫。

應(yīng)用中藥方劑進(jìn)行預(yù)防和治療，組方：白頭翁、馬齒莧、良姜、石榴皮、肉豆蔻、白術(shù)、扁豆、豬苓、厚樸（制）拌料飼喂。每天1次，連續(xù)應(yīng)用30天左右。

采用交叉感染方法預(yù)防，就是把發(fā)病豬的糞便投放到妊娠母豬舍，使其產(chǎn)生強(qiáng)力的母源抗體，對(duì)仔豬產(chǎn)生被動(dòng)保護(hù)作用。該方法經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)，使仔豬感染推遲進(jìn)而減少死亡損失，使該病的流行時(shí)間縮短。

發(fā)病豬場(chǎng)要徹底消毒，每天1次，連續(xù)應(yīng)用，并且還要更換消毒液。對(duì)已發(fā)病豬只進(jìn)行隔離，病死豬作無(wú)害化處理。

病豬要及時(shí)口服補(bǔ)充糖鹽水和碳酸氫鈉，防止脫水和酸中毒。病情嚴(yán)重者，采用靜脈滴注法。有條件的在飼料中添加腐殖酸鈉粉。

5.診斷豬場(chǎng)發(fā)病情況的便捷方法。RT-PCR技術(shù)是迄今最敏感的細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)，而且可以直觀地反映淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力。其缺點(diǎn)是操作較為煩瑣，測(cè)定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平，并且不容易對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行定量。

用金標(biāo)試紙檢測(cè)血清抗原比較特異、方便、易標(biāo)準(zhǔn)化和批量化，很適合臨床應(yīng)用。其缺點(diǎn)是所提供的是免疫活性信息，而不是細(xì)胞因子生物活性信息。綜上，這種方法更適用于診斷豬場(chǎng)發(fā)病情況。

四、結(jié)論

遼寧省朝陽(yáng)市豬流行性腹瀉病毒感染分布較廣，豬流行性腹瀉病毒在各季節(jié)和各日齡階段均有感染，但在氣候偏寒冷的季節(jié)容易感染和發(fā)病，且主要侵害30日齡以內(nèi)的哺乳仔豬。