張 杰，王家林，付麗平，付文靜

（青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東青島 266042）

小麥啤酒的主要用料是小麥芽或者未萌發(fā)的小麥，與大麥相比，小麥芽的蛋白質含量較高，且通常以大分子存在，因小麥蛋白中含有穩(wěn)定因子，較難裂解和去除，這就使得小麥啤酒易產生非生物渾濁[1-2]。小麥啤酒非生物渾濁的成分主要是由高分子敏感蛋白質和敏感多酚交聯(lián)在一起形成的絮凝物[3]。這種敏感蛋白主要由脯氨酸構成，非生物渾濁形成的難易程度與其脯氨酸的含量有直接關系[4-5]，當蛋白質與小分子的多酚經過細微的交聯(lián)結合在一起時，即形成“冷渾濁”；當越來越多的蛋白質和多酚交聯(lián)結合，便構成了“永久性渾濁”[6]。脯氨酸內切酶是一種只作用于脯氨酸的酶，該酶可以通過裂解脯氨酸而使渾濁蛋白失活[7-8]。本實驗主要研究脯氨酸內切酶對小麥啤酒中蛋白質分布的影響，探究脯氨酸內切酶對小麥啤酒的非生物渾濁及泡沫穩(wěn)定性[9]的影響程度，為生產優(yōu)質的小麥啤酒提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料及耗材：大麥芽和小麥芽，青島啤酒有限公司；啤酒酵母，青島科技大學生物工程實驗室菌種；脯氨酸內切酶（酶活力1733 U/mL），青島蔚藍生物科技有限公司。

儀器設備：Hermo legend RT+型離心機EBCLF，武漢愛斯佩科學儀器有限公司；T標準麥芽粉碎機，北京德之杰公司；BGT-8A糖化儀，杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液（pH值為6.5～7）：配制2.72%的KH2PO4溶液和4.56%的K2HPO4溶液，分別從中取28 mL、72 mL，兩者混勻配成100 mL 0.2 mol/L的溶液，再稀釋成0.01 mol/L的溶液。

考馬斯亮藍G250：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到1000 mL。此溶液在常溫下可放置1個月。

1.2.2 小麥啤酒生產工藝

制麥：稱取實驗室大麥芽和小麥芽[10]，在EBC粉碎機中碎粉大麥芽和小麥芽。

糖化：每個糖化杯加入50 g麥芽粉和200 mL蒸餾水，按圖1所示溫度設定程序進行糖化[11]。

圖1 糖化曲線

過濾：糖化后將麥汁降溫至40℃過濾，收集約200 mL濾液[12]。

煮沸：煮沸時間為10 min，期間加入0.15 g啤酒花。

發(fā)酵：取100 mL煮沸完的麥汁加入10 g酵母，放入恒溫箱中以12℃發(fā)酵2 d[13-14]。

泡沫的提?。簩l(fā)酵后的啤酒從距桌面量筒25 cm處往下倒量筒，收集泡沫。

1.2.3 確定實驗方案

確定酶制劑的添加方案見表1。

表1 所用的酶制劑

糖化階段試驗方案見表2。

表2 糖化階段試驗酶添加量

發(fā)酵前階段試驗方案見表3。

表3 發(fā)酵前階段試驗酶添加量

發(fā)酵后階段試驗方案見表4。

表4 發(fā)酵后階段試驗酶添加量

小麥啤酒泡沫試驗方案見表5。

1.2.4 蛋白質的濃縮提純方法

取待測樣液25 mL，緩慢加入10.32 g(NH4)2SO4，使溶液達到80%的飽和度，靜置沉淀1 h后，放入冷凍離心機以轉速9000 r/min離心15 min，棄去上清液，用2.5 mL的1×PBS緩沖液溶解沉淀蛋白，溶解后繼續(xù)離心10 min，用移液槍取2 mL上清液于小離心管中標號等待分析。

表5 小麥啤酒泡沫試驗酶添加量

1.2.5 蛋白含量的測定

將47 mg/mL的標準蛋白樣品進行稀釋，然后測定不同濃度的標準樣品在595 nm波長下的吸光度值和蛋白質含量，繪制標準曲線，取適當稀釋的樣品1 mL與7 mL考馬斯亮藍溶液反應，測其吸光值OD595，然后帶入標準曲線，計算待測樣品的蛋白質含量。

1.2.6 SDS-PAGE電泳實驗

根據待測蛋白質的相對分子質量的范圍，選擇合適的濃縮膠、分離膠濃度，按表6所列的試劑用量配制。利用SDS-PAEG電泳方法測定樣液中蛋白質的分子量。

表6 分離膠與濃縮膠的組成

2 結果與分析

2.1 標準曲線

利用紫外分光光度計測定一系列不同濃度標準蛋白溶液在595 nm處的吸光度值，得到回歸方程y=1.638x+0.0271，R2=0.9989。標準曲線見圖2。

2.2 各階段添加脯氨酸內切酶后麥汁蛋白含量及麥汁蛋白分布

圖2 標準曲線圖

2.2.1 各階段添加脯氨酸內切酶對小麥啤酒中蛋白質分布的影響（圖3、圖4、圖5）

圖3 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

圖4 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

圖5 小麥啤酒泡沫和發(fā)酵后階段電泳圖

2.2.2 各階段添加脯氨酸內切酶后麥汁蛋白的含量

2.2.2.1 糖化階段試驗方案（表7、表8、表9）

表7 糖化時添加脯氨酸內切酶

表8 糖化時添加脯氨酸內切酶

表9 糖化時添加脯氨酸內切酶

⑤麥汁蛋白電泳圖：添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別，且不隨脯氨酸內切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

⑤煮沸后麥汁蛋白電泳圖：煮沸后麥汁中，30～70 KD的大分子蛋白質條帶明顯減少或消失，25 KD的小分子蛋白質條帶明顯增加，說明煮沸過程對麥汁蛋白分子量分布有顯著影響。但與添加酶制劑無明顯關系。

⑤啤酒蛋白電泳圖：空白組在40 KD分子量時，條帶明顯，添加酶制劑后，該條帶邊模糊，說明糖化過程中加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質有一定作用，隨添加量增加而變淺。

表10 發(fā)酵前添加脯氨酸內切酶

2.2.2.2 發(fā)酵前階段試驗方案（表10）

啤酒蛋白電泳圖，前兩組樣品在40 KD分子量時，條帶明顯，后隨著酶制劑添加量的增多，條帶顏色變淺較明顯，且在第3組樣品之后條帶顏色變化不是很大。

2.2.2.3 發(fā)酵后階段試驗方案（表11）

表11 發(fā)酵后添加脯氨酸內切酶

啤酒蛋白電泳圖：空白組在40 KD分子量時，條帶明顯，添加酶制劑后，條帶邊變模糊，說明加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質有一定作用，隨添加量增加條帶顏色逐漸變淺。

2.2.2.4 小麥啤酒泡沫試驗方案（表12）

表12 小麥啤酒泡沫添加脯氨酸內切酶

小麥啤酒泡沫蛋白電泳圖5：從電泳圖中可看出，添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別，且不隨脯氨酸內切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

3 結論

本實驗探究了脯氨酸內切酶對小麥啤酒生產過程中各個階段蛋白分布的影響，研究表明，糖化階段前添加該酶對小麥啤酒中蛋白質的分布影響不大，煮沸過程中由于高溫使酶變性分解；在發(fā)酵階段前添加對小麥啤酒中蛋白質的分布影響較大，42 U/mL為酶的最適添加量；在小麥啤酒發(fā)酵階段后添加對小麥啤酒中蛋白質的分布沒有太大影響；由于小麥啤酒泡沫中脯氨酸的含量較低，加入脯氨酸內切酶后，即使有作用，效果也不顯著。

將脯氨酸內切酶應用于小麥啤酒釀造的過程，是用生物技術手段代替?zhèn)鹘y(tǒng)的吸附分離技術來避免小麥啤酒產生非生物渾濁的一種行之有效的方法，在發(fā)酵前期加入適量脯氨酸內切酶，有利于提高小麥啤酒的非生物穩(wěn)定性，澄清啤酒色澤，改善啤酒品質，為工業(yè)生產提供了理論支持，為加快我國啤酒產業(yè)的健康、快速發(fā)展奠定了堅實的基礎。

[1]劉秀華,滿娟娟,李宏軍.小麥啤酒糖化工藝優(yōu)化[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(13)：7898-7900.

[2]劉捷,喬雨軒,祝忠付,等.啤酒膠體穩(wěn)定性及穩(wěn)定助劑的研究進展[J].中國釀造,2013,32(6)：1-4.

[3]王家林,林琳,韓華,等.脯氨酸內切酶對提高啤酒非生物穩(wěn)定性的研究[J].釀酒科技,2009(2)：47-50.

[4]王丹丹,董國榮.脯氨酸內切酶對啤酒非生物穩(wěn)定性的影響[J].啤酒科技,2014(9)：60-61.

[5]KANG C,YU X W,XU Y.Purification and characterization of a prolyl endopeptidase isolated from Aspergillus oryzae[J].Journal of industrial microbiology&biotechnology,2014,41(1)：49-55.

[6]周全興,硅膠,單寧.脯氨酸內切酶對啤酒影響的對比分析[J].啤酒科技,2014(9)：40-43.

[7]韓珍瓊,任飛,丁吉星.柑桔酒品質穩(wěn)定性的影響因素及控制措施分析[J].中國釀造,2015,34(3)：16-19.

[8]付博,段杉,齊明.酶制劑在啤酒澄清方面的研究進展[J].中國釀造,2017,36(5)：5-8.

[9]周蕓蕓,鄧啟華,方郁野,等.初步探究蛋白質分布情況對啤酒質量的影響[J].啤酒科技,2014(8)：11-19.

[10]耿赟.添加小麥,小麥芽對麥汁及小麥啤酒的影響研究[D].泰安：山東農業(yè)大學,2011.

[11]閆素娟,李紅,賈士儒.提高麥汁發(fā)酵度的糖化工藝優(yōu)化分析[J].釀酒科技,2015(4)：20-27.

[12]黃亞東.CP過濾對啤酒非生物穩(wěn)定性影響的研究[J].釀酒科技,2016(1)：23-25.

[13]韓宇鵬,王金晶,田金鳳,等.啤酒蛋白及其理化特性研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(9)：270-276.

[14]李慧敏,李宏軍,劉秀華,等.上面發(fā)酵和下面發(fā)酵小麥啤酒發(fā)酵過程的差別研究[J].山東理工大學學報:自然科學版,2012,26(2)：41-44.

[15]杜芳.啤酒泡沫蛋白的分離鑒定及啤酒生產中硅膠應用的研究[D].濟南：齊魯工業(yè)大學,2013.