張 杰，王家林，付麗平，付文靜

（青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042）

小麥啤酒的主要用料是小麥芽或者未萌發(fā)的小麥，與大麥相比，小麥芽的蛋白質(zhì)含量較高，且通常以大分子存在，因小麥蛋白中含有穩(wěn)定因子，較難裂解和去除，這就使得小麥啤酒易產(chǎn)生非生物渾濁[1-2]。小麥啤酒非生物渾濁的成分主要是由高分子敏感蛋白質(zhì)和敏感多酚交聯(lián)在一起形成的絮凝物[3]。這種敏感蛋白主要由脯氨酸構(gòu)成，非生物渾濁形成的難易程度與其脯氨酸的含量有直接關(guān)系[4-5]，當?shù)鞍踪|(zhì)與小分子的多酚經(jīng)過細微的交聯(lián)結(jié)合在一起時，即形成“冷渾濁”；當越來越多的蛋白質(zhì)和多酚交聯(lián)結(jié)合，便構(gòu)成了“永久性渾濁”[6]。脯氨酸內(nèi)切酶是一種只作用于脯氨酸的酶，該酶可以通過裂解脯氨酸而使渾濁蛋白失活[7-8]。本實驗主要研究脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)分布的影響，探究脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒的非生物渾濁及泡沫穩(wěn)定性[9]的影響程度，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥啤酒提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料及耗材：大麥芽和小麥芽，青島啤酒有限公司；啤酒酵母，青島科技大學(xué)生物工程實驗室菌種；脯氨酸內(nèi)切酶（酶活力1733 U/mL），青島蔚藍生物科技有限公司。

儀器設(shè)備：Hermo legend RT+型離心機EBCLF，武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司；T標準麥芽粉碎機，北京德之杰公司；BGT-8A糖化儀，杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液（pH值為6.5～7）：配制2.72%的KH2PO4溶液和4.56%的K2HPO4溶液，分別從中取28 mL、72 mL，兩者混勻配成100 mL 0.2 mol/L的溶液，再稀釋成0.01 mol/L的溶液。

考馬斯亮藍G250：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容到1000 mL。此溶液在常溫下可放置1個月。

1.2.2 小麥啤酒生產(chǎn)工藝

制麥：稱取實驗室大麥芽和小麥芽[10]，在EBC粉碎機中碎粉大麥芽和小麥芽。

糖化：每個糖化杯加入50 g麥芽粉和200 mL蒸餾水，按圖1所示溫度設(shè)定程序進行糖化[11]。

圖1 糖化曲線

過濾：糖化后將麥汁降溫至40℃過濾，收集約200 mL濾液[12]。

煮沸：煮沸時間為10 min，期間加入0.15 g啤酒花。

發(fā)酵：取100 mL煮沸完的麥汁加入10 g酵母，放入恒溫箱中以12℃發(fā)酵2 d[13-14]。

泡沫的提取：將發(fā)酵后的啤酒從距桌面量筒25 cm處往下倒量筒，收集泡沫。

1.2.3 確定實驗方案

確定酶制劑的添加方案見表1。

表1 所用的酶制劑

糖化階段試驗方案見表2。

表2 糖化階段試驗酶添加量

發(fā)酵前階段試驗方案見表3。

表3 發(fā)酵前階段試驗酶添加量

發(fā)酵后階段試驗方案見表4。

表4 發(fā)酵后階段試驗酶添加量

小麥啤酒泡沫試驗方案見表5。

1.2.4 蛋白質(zhì)的濃縮提純方法

取待測樣液25 mL，緩慢加入10.32 g(NH4)2SO4，使溶液達到80%的飽和度，靜置沉淀1 h后，放入冷凍離心機以轉(zhuǎn)速9000 r/min離心15 min，棄去上清液，用2.5 mL的1×PBS緩沖液溶解沉淀蛋白，溶解后繼續(xù)離心10 min，用移液槍取2 mL上清液于小離心管中標號等待分析。

表5 小麥啤酒泡沫試驗酶添加量

1.2.5 蛋白含量的測定

將47 mg/mL的標準蛋白樣品進行稀釋，然后測定不同濃度的標準樣品在595 nm波長下的吸光度值和蛋白質(zhì)含量，繪制標準曲線，取適當稀釋的樣品1 mL與7 mL考馬斯亮藍溶液反應(yīng)，測其吸光值OD595，然后帶入標準曲線，計算待測樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 SDS-PAGE電泳實驗

根據(jù)待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的范圍，選擇合適的濃縮膠、分離膠濃度，按表6所列的試劑用量配制。利用SDS-PAEG電泳方法測定樣液中蛋白質(zhì)的分子量。

表6 分離膠與濃縮膠的組成

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

利用紫外分光光度計測定一系列不同濃度標準蛋白溶液在595 nm處的吸光度值，得到回歸方程y=1.638x+0.0271，R2=0.9989。標準曲線見圖2。

2.2 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶后麥汁蛋白含量及麥汁蛋白分布

圖2 標準曲線圖

2.2.1 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)分布的影響（圖3、圖4、圖5）

圖3 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

圖4 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

圖5 小麥啤酒泡沫和發(fā)酵后階段電泳圖

2.2.2 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶后麥汁蛋白的含量

2.2.2.1 糖化階段試驗方案（表7、表8、表9）

表7 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

表8 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

表9 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

⑤麥汁蛋白電泳圖：添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別，且不隨脯氨酸內(nèi)切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

⑤煮沸后麥汁蛋白電泳圖：煮沸后麥汁中，30～70 KD的大分子蛋白質(zhì)條帶明顯減少或消失，25 KD的小分子蛋白質(zhì)條帶明顯增加，說明煮沸過程對麥汁蛋白分子量分布有顯著影響。但與添加酶制劑無明顯關(guān)系。

⑤啤酒蛋白電泳圖：空白組在40 KD分子量時，條帶明顯，添加酶制劑后，該條帶邊模糊，說明糖化過程中加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質(zhì)有一定作用，隨添加量增加而變淺。

表10 發(fā)酵前添加脯氨酸內(nèi)切酶

2.2.2.2 發(fā)酵前階段試驗方案（表10）

啤酒蛋白電泳圖，前兩組樣品在40 KD分子量時，條帶明顯，后隨著酶制劑添加量的增多，條帶顏色變淺較明顯，且在第3組樣品之后條帶顏色變化不是很大。

2.2.2.3 發(fā)酵后階段試驗方案（表11）

表11 發(fā)酵后添加脯氨酸內(nèi)切酶

啤酒蛋白電泳圖：空白組在40 KD分子量時，條帶明顯，添加酶制劑后，條帶邊變模糊，說明加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質(zhì)有一定作用，隨添加量增加條帶顏色逐漸變淺。

2.2.2.4 小麥啤酒泡沫試驗方案（表12）

表12 小麥啤酒泡沫添加脯氨酸內(nèi)切酶

小麥啤酒泡沫蛋白電泳圖5：從電泳圖中可看出，添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別，且不隨脯氨酸內(nèi)切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

3 結(jié)論

本實驗探究了脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒生產(chǎn)過程中各個階段蛋白分布的影響，研究表明，糖化階段前添加該酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布影響不大，煮沸過程中由于高溫使酶變性分解；在發(fā)酵階段前添加對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布影響較大，42 U/mL為酶的最適添加量；在小麥啤酒發(fā)酵階段后添加對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布沒有太大影響；由于小麥啤酒泡沫中脯氨酸的含量較低，加入脯氨酸內(nèi)切酶后，即使有作用，效果也不顯著。

將脯氨酸內(nèi)切酶應(yīng)用于小麥啤酒釀造的過程，是用生物技術(shù)手段代替?zhèn)鹘y(tǒng)的吸附分離技術(shù)來避免小麥啤酒產(chǎn)生非生物渾濁的一種行之有效的方法，在發(fā)酵前期加入適量脯氨酸內(nèi)切酶，有利于提高小麥啤酒的非生物穩(wěn)定性，澄清啤酒色澤，改善啤酒品質(zhì)，為工業(yè)生產(chǎn)提供了理論支持，為加快我國啤酒產(chǎn)業(yè)的健康、快速發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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