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        脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)分布的影響

        2018-03-01 00:33:38王家林付麗平付文靜
        釀酒科技 2018年2期
        關(guān)鍵詞:麥汁脯氨酸條帶

        張 杰,王家林,付麗平,付文靜

        (青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島 266042)

        小麥啤酒的主要用料是小麥芽或者未萌發(fā)的小麥,與大麥相比,小麥芽的蛋白質(zhì)含量較高,且通常以大分子存在,因小麥蛋白中含有穩(wěn)定因子,較難裂解和去除,這就使得小麥啤酒易產(chǎn)生非生物渾濁[1-2]。小麥啤酒非生物渾濁的成分主要是由高分子敏感蛋白質(zhì)和敏感多酚交聯(lián)在一起形成的絮凝物[3]。這種敏感蛋白主要由脯氨酸構(gòu)成,非生物渾濁形成的難易程度與其脯氨酸的含量有直接關(guān)系[4-5],當?shù)鞍踪|(zhì)與小分子的多酚經(jīng)過細微的交聯(lián)結(jié)合在一起時,即形成“冷渾濁”;當越來越多的蛋白質(zhì)和多酚交聯(lián)結(jié)合,便構(gòu)成了“永久性渾濁”[6]。脯氨酸內(nèi)切酶是一種只作用于脯氨酸的酶,該酶可以通過裂解脯氨酸而使渾濁蛋白失活[7-8]。本實驗主要研究脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)分布的影響,探究脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒的非生物渾濁及泡沫穩(wěn)定性[9]的影響程度,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥啤酒提供新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑及儀器

        原料及耗材:大麥芽和小麥芽,青島啤酒有限公司;啤酒酵母,青島科技大學(xué)生物工程實驗室菌種;脯氨酸內(nèi)切酶(酶活力1733 U/mL),青島蔚藍生物科技有限公司。

        儀器設(shè)備:Hermo legend RT+型離心機EBCLF,武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司;T標準麥芽粉碎機,北京德之杰公司;BGT-8A糖化儀,杭州博日科技有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱電子天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 溶液的配制

        磷酸鹽緩沖液(pH值為6.5~7):配制2.72%的KH2PO4溶液和4.56%的K2HPO4溶液,分別從中取28 mL、72 mL,兩者混勻配成100 mL 0.2 mol/L的溶液,再稀釋成0.01 mol/L的溶液。

        考馬斯亮藍G250:稱取100 mg考馬斯亮藍G-250,溶于50 mL 90%乙醇中,再加入85%的磷酸100 mL,最后用蒸餾水定容到1000 mL。此溶液在常溫下可放置1個月。

        1.2.2 小麥啤酒生產(chǎn)工藝

        制麥:稱取實驗室大麥芽和小麥芽[10],在EBC粉碎機中碎粉大麥芽和小麥芽。

        糖化:每個糖化杯加入50 g麥芽粉和200 mL蒸餾水,按圖1所示溫度設(shè)定程序進行糖化[11]。

        圖1 糖化曲線

        過濾:糖化后將麥汁降溫至40℃過濾,收集約200 mL濾液[12]。

        煮沸:煮沸時間為10 min,期間加入0.15 g啤酒花。

        發(fā)酵:取100 mL煮沸完的麥汁加入10 g酵母,放入恒溫箱中以12℃發(fā)酵2 d[13-14]。

        泡沫的提取:將發(fā)酵后的啤酒從距桌面量筒25 cm處往下倒量筒,收集泡沫。

        1.2.3 確定實驗方案

        確定酶制劑的添加方案見表1。

        表1 所用的酶制劑

        糖化階段試驗方案見表2。

        表2 糖化階段試驗酶添加量

        發(fā)酵前階段試驗方案見表3。

        表3 發(fā)酵前階段試驗酶添加量

        發(fā)酵后階段試驗方案見表4。

        表4 發(fā)酵后階段試驗酶添加量

        小麥啤酒泡沫試驗方案見表5。

        1.2.4 蛋白質(zhì)的濃縮提純方法

        取待測樣液25 mL,緩慢加入10.32 g(NH4)2SO4,使溶液達到80%的飽和度,靜置沉淀1 h后,放入冷凍離心機以轉(zhuǎn)速9000 r/min離心15 min,棄去上清液,用2.5 mL的1×PBS緩沖液溶解沉淀蛋白,溶解后繼續(xù)離心10 min,用移液槍取2 mL上清液于小離心管中標號等待分析。

        表5 小麥啤酒泡沫試驗酶添加量

        1.2.5 蛋白含量的測定

        將47 mg/mL的標準蛋白樣品進行稀釋,然后測定不同濃度的標準樣品在595 nm波長下的吸光度值和蛋白質(zhì)含量,繪制標準曲線,取適當稀釋的樣品1 mL與7 mL考馬斯亮藍溶液反應(yīng),測其吸光值OD595,然后帶入標準曲線,計算待測樣品的蛋白質(zhì)含量。

        1.2.6 SDS-PAGE電泳實驗

        根據(jù)待測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的范圍,選擇合適的濃縮膠、分離膠濃度,按表6所列的試劑用量配制。利用SDS-PAEG電泳方法測定樣液中蛋白質(zhì)的分子量。

        表6 分離膠與濃縮膠的組成

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標準曲線

        利用紫外分光光度計測定一系列不同濃度標準蛋白溶液在595 nm處的吸光度值,得到回歸方程y=1.638x+0.0271,R2=0.9989。標準曲線見圖2。

        2.2 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶后麥汁蛋白含量及麥汁蛋白分布

        圖2 標準曲線圖

        2.2.1 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)分布的影響(圖3、圖4、圖5)

        圖3 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

        圖4 糖化階段和發(fā)酵前階段電泳圖

        圖5 小麥啤酒泡沫和發(fā)酵后階段電泳圖

        2.2.2 各階段添加脯氨酸內(nèi)切酶后麥汁蛋白的含量

        2.2.2.1 糖化階段試驗方案(表7、表8、表9)

        表7 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

        表8 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

        表9 糖化時添加脯氨酸內(nèi)切酶

        ⑤麥汁蛋白電泳圖:添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別,且不隨脯氨酸內(nèi)切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

        ⑤煮沸后麥汁蛋白電泳圖:煮沸后麥汁中,30~70 KD的大分子蛋白質(zhì)條帶明顯減少或消失,25 KD的小分子蛋白質(zhì)條帶明顯增加,說明煮沸過程對麥汁蛋白分子量分布有顯著影響。但與添加酶制劑無明顯關(guān)系。

        ⑤啤酒蛋白電泳圖:空白組在40 KD分子量時,條帶明顯,添加酶制劑后,該條帶邊模糊,說明糖化過程中加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質(zhì)有一定作用,隨添加量增加而變淺。

        表10 發(fā)酵前添加脯氨酸內(nèi)切酶

        2.2.2.2 發(fā)酵前階段試驗方案(表10)

        啤酒蛋白電泳圖,前兩組樣品在40 KD分子量時,條帶明顯,后隨著酶制劑添加量的增多,條帶顏色變淺較明顯,且在第3組樣品之后條帶顏色變化不是很大。

        2.2.2.3 發(fā)酵后階段試驗方案(表11)

        表11 發(fā)酵后添加脯氨酸內(nèi)切酶

        啤酒蛋白電泳圖:空白組在40 KD分子量時,條帶明顯,添加酶制劑后,條帶邊變模糊,說明加酶對啤酒40 KD左右的蛋白質(zhì)有一定作用,隨添加量增加條帶顏色逐漸變淺。

        2.2.2.4 小麥啤酒泡沫試驗方案(表12)

        表12 小麥啤酒泡沫添加脯氨酸內(nèi)切酶

        小麥啤酒泡沫蛋白電泳圖5:從電泳圖中可看出,添加酶制劑的電泳條帶與空白無明顯差別,且不隨脯氨酸內(nèi)切酶添加量增加發(fā)生明顯變化。

        3 結(jié)論

        本實驗探究了脯氨酸內(nèi)切酶對小麥啤酒生產(chǎn)過程中各個階段蛋白分布的影響,研究表明,糖化階段前添加該酶對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布影響不大,煮沸過程中由于高溫使酶變性分解;在發(fā)酵階段前添加對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布影響較大,42 U/mL為酶的最適添加量;在小麥啤酒發(fā)酵階段后添加對小麥啤酒中蛋白質(zhì)的分布沒有太大影響;由于小麥啤酒泡沫中脯氨酸的含量較低,加入脯氨酸內(nèi)切酶后,即使有作用,效果也不顯著。

        將脯氨酸內(nèi)切酶應(yīng)用于小麥啤酒釀造的過程,是用生物技術(shù)手段代替?zhèn)鹘y(tǒng)的吸附分離技術(shù)來避免小麥啤酒產(chǎn)生非生物渾濁的一種行之有效的方法,在發(fā)酵前期加入適量脯氨酸內(nèi)切酶,有利于提高小麥啤酒的非生物穩(wěn)定性,澄清啤酒色澤,改善啤酒品質(zhì),為工業(yè)生產(chǎn)提供了理論支持,為加快我國啤酒產(chǎn)業(yè)的健康、快速發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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