孫 雯，鄭 峰

(1.揚(yáng)州科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.中國人民解放軍南京軍區(qū) 軍事醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京 210002)

比較2型豬鏈球菌(S.suis2) ΔRevS突變株和 05ZY/H33 野生株生物學(xué)特性及致病性的差異.首先，通過吸光值測定和革蘭染色比較 △RevS突變株和 05ZY/H33 野生株的生長速度和菌體形態(tài).分別對 Balb/c 及 ICR(CD1)小鼠腹腔注射 109CFU·mL-1的05ZY/H33 菌液，評估兩種品系小鼠對S.suis2 的易感性.分別對 Balb/c 小鼠腹腔注射 2.5×109,5.0×108,1.0×108,2.0×107,4.0×106CFU·mL-1的05ZY/H33 菌液，采用Reed法計算半數(shù)致死量.對 Balb/c 小鼠腹腔注射 5.0×108CFU·mL-1的 ΔRevS突變株和 05ZY/H33 野生株菌液，觀察野生株和突變株對小鼠的影響.對仔豬耳緣靜脈注射 109CFU·mL-1的 05ZY/H33 野生株和 ΔRevS突變株菌液，觀察野生株和突變株對仔豬的影響.體外生物學(xué)特征分析表明，與野生株相比，突變株的生長速率和形態(tài)染色并未發(fā)現(xiàn)顯著變化；Balb/c小鼠對S.suis2 05ZY/H33 的敏感性高于 ICR(CD1)小鼠，05ZY/H33 對Balb/c小鼠的 LD50為 4.2×107CFU·mL-1.Balb/c 小鼠攻毒試驗結(jié)果顯示，ΔRevS對小鼠的致病性明顯減弱.仔豬攻毒試驗結(jié)果顯示，野生株和突變株都引發(fā)仔豬全部死亡，但 ΔRevS引發(fā)仔豬死亡時間較晚.△RevS突變株保持了菌株的基本生物學(xué)特征，但對小鼠和仔豬兩種動物模型的致病作用差異較大.

豬鏈球菌2型(S.suis2)；二元調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；生長曲線；動物模型；半數(shù)致死量

豬鏈球菌(Streptococcussuis)屬于鏈球菌屬中的二級人獸共患病原菌，按其莢膜多糖抗原性不同分為1～34型和1/2型共35種血清型，其中2型豬鏈球菌(S.suis 2)不僅可致豬患嚴(yán)重疾病，如關(guān)節(jié)炎、敗血癥、腦膜炎及心內(nèi)膜炎等，還能感染人致死[1].1998 年和2005年我國江蘇海安和四川資陽都分別暴發(fā)了極其惡劣的S.suis2感染人的疫情，200多例患者出現(xiàn)鏈球菌中毒休克綜合征(streptococcal toxic shock syndrome，簡稱STSS)，病死率高達(dá) 60%～80%，引發(fā)緊急公共衛(wèi)生事件[2].北京基因組所 Chen 等對2005年四川疫區(qū)從STSS患者組織中分離到S.suis2 05ZY/H33 和從健康豬組織中分離到的無毒株 05HAS68 進(jìn)行了全基因組測序和功能注釋[3]，結(jié)果顯示，05ZY/H33 中有15個二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCSTSs)在病原菌感染宿主的過程中，TCSTSs 操縱細(xì)菌對宿主的識別及多種毒力因子的表達(dá)[4].

筆者課題組試圖通過基因敲除、動物模型構(gòu)建及基因芯片等方法系統(tǒng)研究 TCSTSs 在S.suis2 05ZY/H33中的致病作用.吳濤等[5]已對S.suis2 05ZY/H33 中其中一對 TCSTSs 編碼基因RevS(2090rr)進(jìn)行了敲除，成功構(gòu)建了RevS基因敲除突變株(即 △RevS)，為深入研究RevS在S.suis2 致病中的功能，筆者比較了 △RevS突變株和 05ZY/H33 野生株的生物學(xué)特性，并建立小鼠和仔豬兩種動物致病模型來比較 △RevS突變株和 05ZY/H33 野生株的毒力.

1 材料和方法

1.1 材 料

S.suis2 05ZY/H33 野生株分離于2005年四川資陽疫區(qū)，RevS敲除突變株(ΔRevS)由中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所流行病所前期制備；THB(Todd-Hewitt Broth)培養(yǎng)基、壯觀霉素抗生素購買于青島海博生物公司；Balb/c 小鼠(4周齡，(20±1) g，雌性，SPF 級別，合格證號：2016YNB224)、ICR(CD1)小鼠(4周齡，(20±1) g，雌性，SPF 級別，合格證號：2016YNI220)和仔豬(3周齡，(20±1) kg，SPF 級別，合格證號：2016YNP122)購買于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗動物中心；10% 犢牛血清購買于 Difco 公司.

1.2 方 法

1.2.1 生長速率比較

平板劃線法分別在 THB 瓊脂培養(yǎng)上接種培養(yǎng) 05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株，分別挑取 05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株若干單菌落接種于 THB 培養(yǎng)液(不含壯觀霉素和含壯觀霉素)中，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，測定 600 nm處的OD600值作為活菌計數(shù).用 THB 培養(yǎng)液將 05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株菌液稀釋成相同濃度后，分別接種于 THB 培養(yǎng)液中，每隔1 h分別取兩種菌液測定 OD600，然后以細(xì)菌培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以 OD600為縱坐標(biāo)，比較兩種菌株生長曲線的差別(每個菌株設(shè)3管重復(fù)，計算平均值).

1.2.2 革蘭染色比較

根據(jù)上述繪制的細(xì)菌生長曲線，分別將05ZY/H33野生株和 △RevS突變株接種于THB 培養(yǎng)液(含10% 犢牛血清)中培養(yǎng)至對數(shù)期，對這兩種菌液分別進(jìn)行挑菌、干燥固定和革蘭染色，用光學(xué)顯微鏡觀察兩種細(xì)菌的染色形態(tài).

1.2.3 不同品系小鼠敏感性試驗

將S.suis2 05ZY/H33 野生株以劃線法接種于脫纖維羊血 THB 瓊脂平板上，37 ℃ 培養(yǎng) 18 h，挑取若干單菌落接種于THB 培養(yǎng)液(含10% 犢牛血清)中 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h，稀釋(1∶50)后轉(zhuǎn)接于THB 培養(yǎng)液(含10% 犢牛血清) 37 ℃ 再培養(yǎng) 8 h.血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行活菌記數(shù)，確定具體菌量.計數(shù)后的菌液分別對 Balb/c 小鼠及 ICR(CD1)小鼠各20只進(jìn)行腹腔注射 0.5 mL 菌液，另取 Balb/c 及 ICR(CD1)小鼠各20只腹腔注射無菌 THB 作為空白對照.每日4次觀察小鼠精神狀況和臨床表現(xiàn)，并做記錄.選取癥狀嚴(yán)重的小鼠，尾靜脈采血，進(jìn)行細(xì)菌血培養(yǎng).

1.2.4 Balb/c 小鼠半數(shù)致死量(LD50)測定

按上述方法處理S.suis2 05ZY/H33 野生株菌液，血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行活菌記數(shù)后，用 THB 培養(yǎng)液(含10% 犢牛血清)進(jìn)行5倍比稀釋，共稀釋4次，形成 2.5×109，5.0×108，1.0×108，2.0×107，4.0×106CFU·mL-15個濃度梯度.選取60只 Balb/c 小鼠，隨機(jī)等分成6組，1～5組分別腹腔注射 2.5×109，5.0×108，1.0×108，2.0×107，4.0×106CFU·mL-15個稀釋度的菌液，每只 0.5 mL；第6組注射無菌 THB 液體培養(yǎng)基，每只 0.5 mL，作為空白對照組.每天觀察4次，連續(xù)觀察兩周，做記錄.采用 Reed-Muench 計算法[15]計算細(xì)菌對 Balb/c 小鼠的半數(shù)致死量LD50.

1.2.5 05ZY/H33和 ΔRevS對 Balb/c 小鼠攻毒試驗

按上述方法分別處理 05ZY/H33 野生株和 ΔRevS突變株菌液，分別用血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行活菌計數(shù)，使用無菌 THB 培養(yǎng)液(含血清)分別對野生株和突變株菌液進(jìn)行稀釋，使菌液濃度大于 1.0×108CFU·mL-1.選取30只 Balb/c 小鼠，隨機(jī)等分成3組，第1組小鼠腹腔注射稀釋后的 05ZY/H33 野生株菌液，每只 0.5 mL，第2組小鼠腹腔注射稀釋后的 ΔRevS突變株菌液，每只 0.5 mL；第3組小鼠腹腔注射相同體積的 THB 作為空白對照組.每天觀察4次，連續(xù)觀察兩周，做記錄.選取癥狀嚴(yán)重的小鼠，尾靜脈采血，進(jìn)行細(xì)菌血培養(yǎng).

1.2.6 05ZY/H33和 ΔRevS對仔豬攻毒試驗

按上述方法處理處理S.suis2 05ZY/H33 野生株菌液，血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行活菌計數(shù)，將菌液離心濃縮后用滅菌 THB 培養(yǎng)液(含血清)重懸，分別稀釋成 1×1010，1×109，1×108，1×107CFU·mL-1幾個不同濃度，然后分別對仔豬耳緣靜脈注射進(jìn)行預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng) 05ZY/H33 野生株菌液濃度為 1×109CFU·mL-1時，仔豬的臨床癥狀最接近臨床發(fā)病仔豬癥狀，故采用 1×109CFU·mL-1作為仔豬攻毒濃度.分別將 05ZY/H33 野生株和 ΔRevS突變株的菌液濃度調(diào)整至大于 1.0×109CFU·mL-1.購買的18只仔豬，隨機(jī)分成3組.第1組仔豬耳緣靜脈注射 109CFU·mL-1的 05ZY/H33 野生株菌液，每只1 mL；第2組仔豬耳緣靜脈注射 109CFU·mL-1的 ΔRevS突變株菌液，每只1 mL；第3組為空白對照，每只耳緣靜脈注射滅菌 THB 1 mL.每日4次觀察仔豬的臨床表現(xiàn)及死亡情況.對死亡仔豬立即進(jìn)行解剖，無菌采集肝臟、心血組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定.

2 結(jié) 果

2.1 生長速率比較

05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株生長曲線如圖1所示.

圖1 05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株與的生長曲線

圖1顯示，兩者生長速率相近，分別經(jīng)歷3 h遲緩期后進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期.

2.2 革蘭氏染色

分別挑取對數(shù)生長期的 05ZY/H33 野生株和 △RevS突變株菌液進(jìn)行涂片、干燥、固定和革蘭染色、油鏡觀察，結(jié)果見圖2.

圖2 05ZY/H33 野生株(A)和 △RevS突變株(B)革蘭染色鏡檢

圖2顯示，兩者均為革蘭染色陽性鏈狀排列球菌，差別不大.

2.3 不同品系小鼠對 S. suis 2 05ZY/H33 的敏感性

血細(xì)胞計數(shù)器活菌記數(shù)顯示，此次攻毒的細(xì)菌濃度約為 2.5×109CFU·mL-1.Balb/c 實驗組和空白組、ICR(CD1)實驗組和空白組小鼠的臨床表現(xiàn)見表1.圖3中可看出 Balb/c 小鼠對S.suis2 05ZY/H33 的敏感性明顯高于 ICR(CD1)小鼠(p<0.05)，故將選擇 Balb/c 小鼠作為動物模型.發(fā)病小鼠尾靜脈血細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定結(jié)果確定組織標(biāo)本中的細(xì)菌是S.suis2 05ZY/H33，提示腹腔中的S.suis2 能夠進(jìn)入小鼠血循環(huán).

表1 攻毒后 Balb/c 和 ICR(CD1)小鼠臨床表現(xiàn)

圖3 Balb/c 和 ICR(CD1)小鼠攻毒后死亡情況

2.4 Balb/c小鼠半數(shù)致死量(LD50)計算

參考 Reed-Muench 法計算得出S.suis2 05ZY/H33 對 Balb/c 小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為 4.2×107CFU(見表2).

表2 Balb/c小鼠死亡情況

2.5 05ZY/H33 和 ΔRevS對 Balb/c 小鼠攻毒試驗比較

通過5倍比稀釋，活菌記數(shù)顯示，05ZY/H33 與 ΔRevS菌液濃度為 5.0×108CFU·mL-1達(dá)到半數(shù)致死量(見圖4).

圖4 Balb/c小鼠死亡情況

由圖4可以看出， 05ZY/H33 實驗組小鼠全部死亡，ΔRevS實驗組小鼠1只死亡(p<0.05)，空白對照組小鼠沒有死亡.兩組發(fā)病小鼠尾靜脈血細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定結(jié)果確定組織標(biāo)本中的細(xì)菌分別是 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突變株，提示兩組細(xì)菌均可通過腹腔進(jìn)入小鼠血循環(huán).

2.6 05ZY/H33 和 ΔRevS對仔豬攻毒試驗比較

通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng) 05ZY/H33 菌液濃度為 1×109CFU·mL-1時，仔豬的臨床癥狀最接近臨床發(fā)病仔豬癥狀，故將 05ZY/H33 與 ΔRevS菌液濃度調(diào)整為 1.0×109CFU·mL-1.05ZY/H33 實驗組仔豬、ΔRevS實驗組仔豬和空白組仔豬的臨床表現(xiàn)見表3所列.05ZY/H33野生株和ΔRevS突變株對仔豬攻毒的成活結(jié)果如圖5所示.

表3 攻毒后仔豬臨床表現(xiàn)

圖5 05ZY/H33 野生株和 ΔRevS突變株對仔豬攻毒試驗比較

由圖5可以看出，05ZY/H33 實驗組和 ΔRevS實驗組仔豬全部死亡，空白對照組仔豬沒有死亡，但 05ZY/H33 實驗組仔豬 48 h 全部死亡，ΔRevS實驗組仔豬 96 h 出現(xiàn)死亡，120 h 全部死亡.解剖、組織器官細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定顯示，死亡仔豬的腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大并出血，腸壁點(diǎn)狀出血，肺、肝、腎淤血，脾臟邊緣壞死.野生株和突變株均在死亡仔豬的淋巴結(jié)、心、肺、腎、肝、脾及腦脊液等部位存在.

3 討 論

筆者通過比較 △RevS突變株和 05ZY/H33 野生株的生長速度和革蘭染色特性，發(fā)現(xiàn)兩種菌株沒有明顯差異，因此RevS基因的缺失可能不會影響S.suis2 的基本生物學(xué)特性.

國外報道提到，不同品系的小鼠對致病性S.suis的敏感性不同，即使同一品系的小鼠其敏感性也不一定相同[6-7].Kataoka 等[8-9]指出 ICR(CD1)小鼠對S.suis的敏感性較差，Gottschalk M 的觀點(diǎn)則完全相反[10]，這可能是由于小鼠飼養(yǎng)環(huán)境和菌株來源的差異所致.鑒于國內(nèi)外均有 Balb/c 小鼠和 ICR(CD1)小鼠對S.suis較敏感的報道[11-12]，且兩者均屬于國內(nèi)常用實驗小鼠，故在該研究中選取 Balb/c 小鼠和 ICR(CD1)小鼠這兩種品系測試對S.suis2 05ZY/H33 的敏感程度.結(jié)果顯示，該攻毒實驗中，Balb/c 小鼠比 ICR(CD1)小鼠表現(xiàn)出對 05ZY/H33更敏感的特點(diǎn).這可能是因為 ICR(CD1)小鼠的生長速度快，隨著日齡的增加，敏感性變化較大，而 Balb/c 小鼠生長速度緩慢，在一段時間內(nèi)敏感性則較為穩(wěn)定.

筆者接著選取 Balb/c 小鼠作為模型動物，并參考了 Beaudoin[13]建立的標(biāo)準(zhǔn)化豬鏈球菌小鼠致病模型，攻毒前對 Balb/c 小鼠的日齡、05ZY/H33 菌株培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中是否添加血清等細(xì)節(jié)進(jìn)行參數(shù)評估，最終得出最佳攻毒方案.評估顯示，培養(yǎng)時間對細(xì)菌毒力影響較大，這與Beaudoin等[13]的報道一致.相比于 PBS，用 THB 培養(yǎng)液對細(xì)菌稀釋效果更好.此外，培養(yǎng)基中添加 10% 的犢牛血清，細(xì)菌毒力會更強(qiáng).之前多數(shù)小鼠模型的建立者認(rèn)為小鼠能夠模擬豬或人的感染，從而有效區(qū)分S.suis強(qiáng)、弱毒株，Vecht 研究小組[14]卻發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌對小鼠和豬的致病性有時完全不同，小鼠和豬的器官損傷差異也較大，并推測S.suis對動物的致病性存在宿主差異性，小鼠模型的可信度并不高.鑒于小鼠模型比較經(jīng)濟(jì)方便，可以將小鼠和豬這兩種動物模型相結(jié)合，更加可行也可信[15].筆者研究的 Balb/c 小鼠攻毒試驗結(jié)果顯示，攻毒劑量為5.0×108CFU·mL-1時，05ZY/H33 實驗組小鼠在 24 h 內(nèi)全部死亡(而在 Balb/c 小鼠半數(shù)致死量測定時，小鼠在 96 h 內(nèi)全部死亡，這可能是小鼠個體差異性所致)，ΔRevS突變株只導(dǎo)致了1只小鼠的死亡，提示在 Balb/c 小鼠模型中RevS可能與S.suis2 的致病相關(guān).此外，攻毒劑量隨著實驗動物的種類、大小、年齡等特性的不同而隨之變化，鑒于國內(nèi)外學(xué)者所建立的S.suis2 仔豬感染模型的攻毒劑量大多在 1.0×107～1.0×1010CFU·mL-1范圍內(nèi)，筆者首先在仔豬模型預(yù)實驗中比較了 107，108，109，1010CFU·mL-14個不同濃度，最終發(fā)現(xiàn) 1.0×109CFU·mL-1較為合適.仔豬攻毒試驗結(jié)果顯示，05ZY/H33 野生株和 ΔRevS突變株在仔豬致病性上存在相似性，最終都導(dǎo)致仔豬全部死亡.但 05ZY/H33 野生株毒力較強(qiáng)，能引發(fā)仔豬在未表現(xiàn)出顯著臨床癥狀前急速死亡，而 ΔRevS突變株毒力相對較弱，引發(fā)仔豬 96 h 才出現(xiàn)死亡，120 h 全部死亡，臨床癥狀明顯.

綜上所述，ΔRevS突變株對小鼠和仔豬兩種動物模型的致病作用差異較大.這可能是由于宿主的差異導(dǎo)致S.suis2 感染過程中涉及的毒力成分及應(yīng)對的宿主應(yīng)答方式不同[16]，在相關(guān)文獻(xiàn)中也有報道.其次，攻毒方式的不同也可能導(dǎo)致 ΔRevS突變株對小鼠和仔豬兩種動物致病性的差異，由于S.suis是一種條件致病菌，只有當(dāng)豬免疫力下降或應(yīng)激狀態(tài)下才會感染此菌[17]，研究者嘗試了多種攻毒方式模擬S.suis的天然感染狀態(tài)，但結(jié)果卻不理想[18].S.suis2 中的 RevS與產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)中VirR/S氨基酸序列同源性很高，VirR/S 在C.perfringens中可全面調(diào)控溶血素、蛋白酶、磷脂酶C、膠原酶、唾液酸酶、血凝素等多種毒力因子的表達(dá)[19].由于S.suis2 中也含有上述類似成分，推測RevS在S.suis2 中也參與這些毒素組分的調(diào)控[20].

動物模型可直觀評價病原菌中致病因子的作用，但鑒于S.suis動物模型存在有效性的爭議，該試驗結(jié)果中兩種動物模型的致病表現(xiàn)有必要進(jìn)行深入探討.筆者課題組下一步將利用基因芯片技術(shù)研究RevS編碼基因敲除后對S.suis2中其他毒力蛋白轉(zhuǎn)錄的影響，尋找 RevS的調(diào)控基因，為揭示S.suis2 感染過程中涉及的分子致病機(jī)制提供思路.

[1] ZHANG Y Y, DING D D, LIU M L, et al. Effect of the glycosyltransferases on the capsular polysaccharide synthesis ofStreptococcussuisserotype 2[J]. Microbiological Research, 2016, 185 (1): 27-37.

[2] TANG J, WANG C, FENG Y, et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused byStreptococcussuisserotype 2[J]. PLoS Med, 2006, 3 (2): 151-155.

[3] CHEN C, TANG J, DONG W, et al. A glimpse of streptococcal toxic shock syndrome from comparative genomics ofS.suis2 Chinese isolates[J]. PLoS ONE, 2007, 2 (3): 315-320.

[4] LAZAR A N R, ALLOOD E M, DEVESON L D, et al. Perturbation of the two-component signal transduction system, BprRS, results in attenuated virulence and motility defects inBurkholderiapseudomallei[J]. BMC Genomics, 2016, 17 (1): 331-336.

[5] WU T, CHANG H, TAN C, et al. The orphan response regulator RevSC21 controls the attachment ofStreptococcussuisserotype 2 to human laryngeal epithelial cells and the expression of virulence genes[J]. FEMS Microbiology Letters, 2009, 292 (2): 170-181.

[6] GE G A, VAN S S, BUYS H, et al. Pneumococcal colonization and invasive disease studied in a porcine model[J]. BMC Microbiology, 2016, 16 (1): 102-108.

[7] MANDANICI F, GOMEZ G L, GARIBALDI M, et al. A surface protein ofStreptococcussuisserotype 2 identified by proteomics protects mice against infection[J]. Journal of Proteomics, 2010, 73 (12): 2365-2369.

[8] KATAOKA Y, YAMASHITA T, SUNAGA S, et al. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibody againstStreptococcussuistype 2 in infected pigs[J]. The Journal of Veterinary Medical Science, 1996, 58 (4): 369-372.

[9] KATAOKA Y, YOSHIDA T, SAWADA T. A 10 year survey of antimicrobial susceptibility ofstreptococcussuisisolates from swine in Japan[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2000, 62 (10): 1053-1057.

[10] TURGEON P L, HIGGINS R, GOTTSCHALK M, et al. Antimicrobial susceptibility ofStreptococcussuisisolates[J]. The British Veterinary Journal, 1994, 150 (3): 263-269.

[11] BERTHELOT H F, GOTTSCHALK M, MORVAN H, et al. Dilemma of virulence ofStreptococcussuis: Canadian isolate 89-1591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs[J]. Canadian Journal of Veterinary Research, 2005, 69 (3): 236-240.

[12] VECHT U, STOCKHOFE Z N, TETENBURG B J, et al. Murine and pig models ofStreptococcussuistype 2 infections are incompatible[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1997, 418 (11): 827-829.

[13] BEAUDOIN M, HIGGINS R, HAREL J, et al. Studies on a murine model for evaluation of virulence ofStreptococcussuiscapsular type 2 isolates[J]. FEMS Microbiology Letters, 1992, 78 (23): 111-116.

[14] Vecht U, Stockhofe-Zurwieden N, Tetenburg B J, et al. Virulence ofStreptococcussuistype 2 for mice and pigs appeared host-specific[J]. Veterinary Microbiology, 1998, 58 (1): 53-60.

[15] LI J, XIA J, TAN C, et al. Evaluation of the immunogenicity and the protective efficacy of a novel identified immunogenic protein, SsPepO, ofStreptococcussuisserotype 2[J]. Vaccine, 2011, 29 (38): 6514-6519.

[16] WANG Y, ZHANG W, WU Z F, et al. Reduced virulence is an important characteristic of biofilm infection ofStreptococcussuis[J]. FEMS Microbiology Letters, 2011, 316 (1): 36-43.

[17] TARRADAS C, BORGE C, LUQUE I, et al. Suilysin production byStreptococcussuisstrains isolated from diseased and healthy carrier pigs in Spain[J]. Veterinary Record, 2001, 148 (14): 183-184.

[18] JOBIN M C, MARTINE G, GRENIER D. Cloning, purification, and enzymatic properties of dipeptidyl peptidase IV from the swine pathogenStreptococcussuis[J]. J Bacteriol, 2005, 187 (22): 795-799.

[19] WANG H H, SHEN X D, ZHAO Y, et al. Identification and proteome analysis of the two-component VirR / VirS system in epidemicStreptococcussuisserotype 2[J]. FEMS Microbiol Lett, 2012, 333 (2): 327-335.

[20] CHEUNG J K, KEYBURN A L, CARTER G P, et al. The VirSR two-component signal transduction system regulates NetB toxin production in Clostridium perfringens[J]. Infection and Immunity, 2010, 78 (7): 3064-3072.