張春芝，莫寅斌，江志國，章洋

（寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術學院，寧夏銀川750199）

甜瓜（Cucumis melo L.）又稱洋香瓜，香瓜等，屬葫蘆科甜瓜屬，是一種世界性的重要水果。其果實汁多而味甜，具有濃郁的香氣，并含有大量人體所需的葡萄糖、維生素、有機酸及礦物質；據(jù)測定，甜瓜果實干物質含量6%～18.5%，其中總糖含量為4.6%～15.8%（包括葡萄糖2%～3.6%，果糖0.5%～3.6%，蔗糖1%～11.2%）；果酸0.054%～0.128%；果膠0.8%～4.5%；纖維素和半纖維素2.6%～6.7%；而且每100克甜瓜中含有維生素C 29 mg～39.1 mg。寧夏得天獨厚的光熱資源和區(qū)位優(yōu)勢，甜瓜產業(yè)得到了快速發(fā)展，已經成為寧夏中部干旱帶的優(yōu)勢特色農業(yè)產業(yè)。同時也為生產甜瓜酒，豐富酒類產品品種，提高產品的高附加值，奠定了扎實的物質基礎[1-2]。

酵母菌是甜瓜酒釀造過程中最重要的微生物，它不但影響發(fā)酵速度，也影響著甜瓜酒的品質和風格[3-5]。生產甜瓜酒一般都是利用商業(yè)酵母作為發(fā)酵菌株[6-7]，而選擇利用來源于甜瓜的酵母進行甜瓜酒發(fā)酵報道不多[8-9]。本研究以自然發(fā)酵的甜瓜汁作為分離源進行酵母菌的分離、純化與鑒定，得到適合釀造甜瓜酒的酵母菌株NT13。并對其釀酒特性進行探索研究，為進一步開展甜瓜酒的應用和開發(fā)研究提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 樣品

選擇成熟度好的寧夏黃甜瓜，購自銀川市農貿市場。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖(YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L（固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L）。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.042 5%、氯化鈣0.012 5%、氯化鐵0.000 25%、硫酸鎂0.012 5%、硫酸錳0.000 25%、溴甲酚綠0.002 2%、瓊脂2%，pH 6.5；121℃滅菌20 min。

氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基[10]：由上層培養(yǎng)基與下層培養(yǎng)基組成。其中TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現(xiàn)配現(xiàn)用；TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。

甜瓜汁培養(yǎng)基：以甜瓜為原料制備的清汁，糖度為 18°Brix，100℃滅菌 10 min。

1.2 儀器與設備

T6新悅-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；H.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；pHS-3C酸度計：上海虹益儀器廠；手持糖度計：上海米青科實業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面潔凈工作臺：蘇潔凈化設備有限公司；DYCP-31DN DNA電泳槽：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；2720 thermal cycler PCR儀：Applied Biosystems公司；HC-2518R冷凍高速離心機：BBI公司；SP10-1000 Surf系列精密單道可調移液器：上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離

取新鮮成熟度好的甜瓜，帶皮剁碎，稱取100 g裝入500 mL無菌三角瓶中，用無菌紗布蓋住瓶口，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，待發(fā)酵醪液出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象后即可分離。將上述發(fā)酵醪液適當稀釋，取0.2 mL涂布于YPD培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行，28℃培養(yǎng)2 d～3 d。長出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落采用劃線分離法進一步純化。將純化后的酵母菌種置于4℃冰箱保藏。

1.3.2 酵母菌的初篩

將分離純化后的酵母菌株以劃線分離的方式接種到WL營養(yǎng)培養(yǎng)基進行釀酒酵母的篩選，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～5 d后，觀察菌落特征。

1.3.3 酵母菌的復篩

一級復篩：TTC顯色法對初篩得到的酵母菌株的產酒精能力進行測定[11]。挑取紅色菌落進行二級篩選。

二級復篩：利用杜氏管發(fā)酵法[12]，在同等條件下，將一級篩選得到的菌株進行活化，以10%的接種量接入附有杜氏小管的甜瓜汁培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管中產氣情況。選取起酵速度快且發(fā)酵能力強的菌株進入三級篩選。

三級復篩：將二級篩選的菌株繼續(xù)培養(yǎng)1 d，由5位有品嘗經驗的教師組成的品評小組對發(fā)酵液進行感官評定酒的風味（色澤、香氣等）。

1.3.4 菌株的生理生化特性試驗

1.3.4.1 糖發(fā)酵鑒定[13]

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、棉子糖進行糖發(fā)酵試驗，菌株作3個重復。

1.3.4.2 同化碳源試驗[13]

分別用D-半乳糖、蔗糖、麥芽糖、D-木糖、纖維二糖、海藻糖、D-核糖、檸檬酸、乳糖、L-鼠李糖、肌醇、D-甘露糖、山梨醇、菊糖代替YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖，菌株作3個重復。

1.3.5 菌株耐受性測定[14-15]

采用杜氏管發(fā)酵法，將篩選得到的菌株活化后分別以5%的接種量接種到不同含糖量（250、280、310、340、370、400、420 g/L）、不同乙醇含量（10%、12%、14%、15%、16%、17%和18%）、不同pH值（3.73、3.37、3.08、2.96、2.87、2.80 和 2.74）、不同 SO2濃度（120、160、200、230、250、280、300 mg/L） 的 10 mL 附有杜氏小管的滅菌甜瓜汁中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管中氣體的高度，以未做處理的甜瓜汁培養(yǎng)基作對照。

1.3.6 酵母菌性質實驗

1.3.6.1 菌株的產乙醇能力

甜瓜汁發(fā)酵法：將篩選得到的酵母菌株活化，以6%的接種量接種到200 mL滅菌甜瓜汁中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，采用密度瓶法測定其乙醇體積分數(shù)[16]。

1.3.6.2 菌株的生長曲線測定[17]

將篩選得到的酵母菌株接種到滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌株的生產情況，前期間隔2 h取樣，后期間隔12 h取樣，用可見分光光度計在560 nm波長處測定吸光度，重復3次，繪制菌株的生長曲線。

1.3.7 酵母菌的分子生物學鑒定

采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析對篩選出的酵母菌株進行分子生物學鑒定[17]。將菌株平板送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測定的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中區(qū)域序列進行BLAST比對，分析該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離

經初步分離，共得到56株具有典型酵母菌菌落特征的菌株，分別記號為NT1～NT56。

2.2 酵母菌的初篩

通過WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的初步篩選，挑取菌落顏色為奶油色至綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀的單菌落，共篩選出23株。

2.3 酵母菌的復篩

2.3.1 一級篩選

通過TTC顯色反應篩選出9株菌落顏色為紅色或深紅色的菌株 （圖 1），分別為 NT4、NT6、NT11、NT13、NT17、NT29、NT34、NT42、NT45，說明產酒精能力強。

圖1 TTC顯色反應結果Fig.1 Yeast strain cultured in TTC chromogenic medium

2.3.2 二級篩選

將9株一級篩選的菌株接種到附有杜氏小管的甜瓜汁培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察產氣情況，結果見表1。

表1 酵母菌的杜氏小管產氣情況Table 1 The produce gas of 9 yeast strains

由表1可知，有5株酵母產氣充滿杜氏小管，并能聞到淡淡的酒香，說明這些菌株具有較強的起酵能力和發(fā)酵力。

2.3.3 三級篩選

將5株二級篩選的菌株繼續(xù)培養(yǎng)1 d，進行感官評定，結果見表2。

表2 5株酵母菌株發(fā)酵甜瓜酒的感官評定Table 2 The sensory evaluation of 5 yeast strains fermented melon wine

經過綜合評定，NT13菌株發(fā)酵的甜瓜酒，色澤金黃，酒香濃郁，果香典型性強，適合作為甜瓜酒發(fā)酵菌種。

2.4 菌株生理生化鑒定

將NT13菌株進行進一步生理生化鑒定，結果見表3。

表3 酵母NT13菌株利用碳源試驗Table 3 The carbon sources tested of NT13

根據(jù)表3的試驗結果，對比《真菌鑒定手冊》初步判斷NT13菌株為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.5 NT13菌株耐受性測定

2.5.1 耐糖量測定

試管中加入10 mL完全溶解的不同糖濃度的甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表4。

由表4可知，NT13菌株在含糖量為40%左右，可以良好地生長，且香氣較好，符合果酒酵母的要求。

表4 NT13菌株在不同糖濃度下的生長情況Table 4 The effects of different sugar content to NT13

2.5.2 耐酒精測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后分別加入食用酒精，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表5。

表5 NT13菌株在不同乙醇體積分數(shù)下的生長情況Table 5 The effects of different alcohol content to NT13

由表5可知，NT13菌株可以耐受17%vol的乙醇，符合一般發(fā)酵果酒10%vol～14%vol的乙醇含量的要求。

2.5.3 耐pH值測定

試管中加入10 mL以檸檬酸調整pH值后的甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表6。

表6 NT13菌株在不同pH值下的生長情況Table 6 The effects of different pH to NT13

由表6可知，NT13菌株能夠在pH2.74的條件下存活，說明其耐酸能力可以達到果酒釀造要求。

2.5.4 耐SO2測定

試管中加入10 mL甜瓜汁培養(yǎng)基，滅菌冷卻后分別加入亞硫酸，搖勻后以5%的接種量接入NT13菌株，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d，觀察杜氏小管的產氣高度，結果見表7。

表7 NT13菌株在不同質量濃度SO2下的生長情況Table 7 The effects of different SO2concentrations to NT13

表7可知，NT13菌株有較強的SO2耐受能力，符合國標中對于果酒中SO2的最大殘留量250 mg/L的要求。試驗證明其在250 mg/L的條件下依然有較好的香氣。

2.6 NT13菌株性質試驗

2.6.1 產乙醇能力

根據(jù)GB 5009.225-2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》酒精度的測定方法，采用第一法即密度瓶法進行測定，結果見表8。

表8 NT13菌株產乙醇能力Table 8 The ethanol yield of NT13

將試驗結果代入計算公式，查附錄A后可得出NT13菌株產乙醇約為10.9%vol。

2.6.2 生長曲線測定

NT13菌株的生長曲線見圖2。

由圖2可見，培養(yǎng)2 h后NT13菌株大量生長繁殖，菌量以指數(shù)級增加，10 h后達到最高值，之后趨于穩(wěn)定。這與文獻有關酵母生長曲線的報道一致[18]。

2.7 NT13菌株的分子生物學鑒定

2.7.1 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結果

NT13菌株PCR產物瓊脂糖電泳圖見圖3，NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結果見表9。

圖2 NT13菌株的生長曲線Fig.2 The microbial growth curve of yeast NT13

圖3 NT13菌株PCR產物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR products by agaros electrophoresis of yeast NT13

表9 NT13菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定結果Table 9 Identification result based on 26S rDNA D1/D2 of NT13

如圖3所示，NT13菌株的26S rDNA序列長度為594 bp。經基因測序，在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST序列比對（表9），結果表明NT13與酵母屬釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae相似性為100%，故將其鑒定為酵母屬釀酒酵母。

3 結論

本試驗從寧夏黃甜瓜自然發(fā)酵醪中分離篩選出1株優(yōu)良酵母菌，該菌株產酒精能力和發(fā)酵能力強。經感官鑒定，產果香酒香濃郁，典型性強。耐受實驗結果表明其能夠耐受40%的含糖量、18%的乙醇和300 mg/L的SO2含量，能夠在pH2.74的酸性條件下良好生長。通過密度瓶法測其能夠自然發(fā)酵產乙醇約為10.9%vol，生長曲線測定實驗表明菌量在2 h后以指數(shù)級增加，10 h后趨于穩(wěn)定。經生理生化鑒定及26S rDNA D1/D2鑒定為酵母屬釀酒酵母。以上試驗結果表明，NT13菌株符合一般果酒發(fā)酵的要求，可以應用于甜瓜酒的釀造。但有關該酵母菌的發(fā)酵工藝特性還有待于進一步研究。

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