符 珉，龍 靜，徐智垚，李宗成，李 磊，成 鑫，鄒 平

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）是一種常見的臨床疾病，其發(fā)病率高達15%，在CDK發(fā)展進程的每一階段都涉及心血管系統(tǒng)的損害，而且慢性腎功能衰竭病人最終死亡的原因近50%是心血管疾患[1]。心腎綜合征（cardiorenal syndrome，CRS）是指心臟和腎臟其中一個器官的急性或慢性功能障礙可能導致另一器官的急性或慢性功能損害的臨床綜合征。根據(jù)其初始器官損害不同和發(fā)病機制的不一樣，分為5個亞型，其中CRS四型即慢性腎心綜合征[2]，是以CDK導致心功能損害、增加罹患心血管意外的風險為特征[3-4]，其機制尚未完全闡明，也缺乏早期診斷的可靠指標。本實驗通過5/6腎切除擬建立慢性腎心綜合征大鼠動物模型，并用高頻超聲檢測該模型的心功能改變，從而評價高頻超聲在慢性腎心綜合征大鼠動物模型研究中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物清潔級雄性SD大鼠24只，體重（250.0±20.0）g，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供。戊巴比妥鈉：進口分裝。儀器：使用GE E9彩色多普勒超聲診斷儀，所選探頭為線陣高頻探頭12SS-D Cardiac Probe，所用頻率為12 MHz（由西南醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科提供）。

1.2 慢性腎心綜合征動物模型的制備

適宜溫度及標準飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后在尾部標注好數(shù)字，稱重，采用隨機數(shù)字表法分為2組，各12只，模型組和假手術組。模型組大鼠行5/6腎臟切除手術，按照0.5%戊巴比妥鈉1 mL/100g的劑量通過腹腔注射方式麻醉大鼠，然后采取俯臥體位固定于手術臺上，局部剪毛、備皮，用碘伏、酒精行常規(guī)皮膚消毒，無菌操作下于左肋下脊直肌外側(cè)距左脊肋骨約1.5 cm處行斜向外下方（腎區(qū)）做一長約3～4 cm的切口，逐層切開，對肌層行鈍性分離，充分暴露左腎，從腎下極向上剝離腎臟包膜但不剪掉（保留腎上腺）；用止血鉗夾閉腎臟上下極，待夾閉區(qū)域變成紫黑色后，用組織剪剪去左腎上下極約2/3腎組織，注意不要剪到腎竇，迅速用明膠海綿壓迫出血區(qū)域，逐層縫合關閉腹壁。腹腔內(nèi)注入慶大霉素，7 d后行第2次手術，采用同樣的方法麻醉大鼠并暴露右腎，結扎右腎腎蒂，待腎臟缺血變深色時切除右腎。最終手術共計切除大鼠左右腎臟總和的約5/6。每次術后應保持大鼠呼吸順暢，禁食1 d，無需禁水，術后3 d密切觀察大鼠手術切口及一般情況。假手術組只行相同的麻醉、模擬過程，找到其腎臟但不做腎切除術[5-6]。

1.3 超聲心動圖檢測

各組大鼠于第10周末行胸部剪毛備皮，以0.5%戊巴比妥鈉1 mL/100g麻醉，將其仰臥位放置于木板，軀體略左傾（麻醉過程中死亡2只）。超聲高頻探頭置于大鼠胸骨左側(cè)，根據(jù)圖像顯示選擇探頭旋轉(zhuǎn)角度，以圖像效果清晰為準。首先在二維超聲模式下顯示出大鼠胸骨旁左室長軸切面，左室短軸切面，大動脈短軸切面以及心尖四腔心切面聲像圖，觀察心臟房室大小有無改變，心臟瓣膜及室壁室隔的搏幅運動及回聲情況。在左室短軸切面及長軸切面，引出M型曲線，因大鼠心率較快，即使在麻醉狀態(tài)下也高達300余次，因此為保證圖像分辨率，將M型超聲掃描速度提高至200 mm/s，待圖像穩(wěn)定后，選著較好處進行測量。測量心臟形態(tài)學參數(shù)包括:舒張末期的左室后壁及室間隔厚度（LVPWDd、IVS?Dd），左室舒張末期和在收縮末期的內(nèi)徑測值（LVEDd、LVESd），收縮期的左室后壁和室間隔厚度測值（LVPWSd、IVSSd）。測量心臟功能的指標：左室射血分數(shù)及短軸縮短率（EF、FS）。接著將探頭放于心尖，顯示心尖四腔心切面，啟用TDI模式[7-8]，將取樣線置于室間隔與二尖瓣環(huán)交界處，盡量使室壁長軸與超聲聲束方向平行，仍然選擇掃描速度為200 mm/s，調(diào)整好速度標尺，獲得后間隔處二尖瓣環(huán)運動頻譜，觀察各瓣口血流情況。

1.4 腎功能及心、腎組織病理檢測

超聲心動圖檢測完成后經(jīng)腹主動脈采取血樣，做血清肌酐、尿素氮檢測；采取斷頸法處死實驗動物，取出心、腎于中性甲醛中固定。HE染色法檢測心、腎組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.8統(tǒng)計軟件處理分析，以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，統(tǒng)計結果以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的一般狀況

第10周末，假手術組大鼠無死亡，一般狀況良好，飲食正常，行動靈活，皮毛光滑；模型組大鼠先后死亡3只（不包括做超聲心動圖檢測前麻醉過程中死亡的2只），存活的大鼠表現(xiàn)為進食減少，精神萎靡，皮毛光澤度差，活動度減少。

2.2 各組大鼠的超聲心動圖檢測情況

2.2.1 各組大鼠心臟超聲圖像比較

各組大鼠均獲得較滿意的圖像效果，大鼠心率很快，高達300余次，左室發(fā)達，左室長軸切面見左室腔近似橢圓體，約占據(jù)整個畫面2/3，右心室較小，緊貼前壁，二尖瓣及主動脈瓣開放關閉自如，心尖四腔清晰，顯示四個房室及二、三尖瓣，心尖五腔心切面在心尖四腔心基礎上還可顯示左室流出道。左室短軸切面顯示左室呈圓形，收縮期一致向心性收縮，二尖瓣位于左室中，前后葉呈鏡像運動，舒張期呈“魚口”樣張開。二尖瓣瓣口血流頻譜為基線以上雙峰形，主動脈瓣血流頻譜為基線以下單峰形，略似倒三角形，肺動脈瓣血流頻譜與主動脈相似。TDI測后間隔處二尖瓣環(huán)運動顯示為正向單峰負向雙峰共三峰的曲線圖像。上述超聲圖像證明大鼠心臟結構與人類相似，但由于大鼠心臟太小且心率過快，難以通過肉眼發(fā)現(xiàn)各組形態(tài)上的區(qū)別（圖1）。

圖1 各組大鼠心臟超聲圖像

2.2.2 各組大鼠心臟超聲測值比較

模型組與假手術組大鼠心臟超聲測值比較，其形態(tài)學指標室間隔舒張期厚度（IVSd）、室間隔收縮期厚度（IVSs）均值減少，但P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；模型組大鼠心臟左室在舒張末期的內(nèi)徑（LVIDd），與假手術組比較有明顯增加（P＜0.05），提示左心室擴大；模型組大鼠心臟在收縮末期的左室內(nèi)徑（LVIDs）和舒張末期的左室后壁厚度（LVPWd）與假手術組比較無顯著增加（P＞0.05）。模型組心臟超聲功能學指標左室射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）比假手術組均有降低（P＜0.01），提示5/6腎切除后心功能明顯降低（表1）。

表1 心臟超聲形態(tài)與功能學測值比較（x±s，n=6）

2.3 腎功能指標

模型組大鼠血清肌酐和尿素氮測值均較假手術組顯著升高（P＜0.01），表明5/6腎切除致慢性腎功能障礙（表2）。

表2 各組的血肌酐、尿素氮測值比較（x±s）

2.4 各組大鼠腎、心組織HE染色結果

HE染色光鏡下觀察，可見假手術組腎小球分布密集，呈圓形或橢圓形，外周規(guī)整，球內(nèi)毛細血管密集，腎小管的管腔規(guī)整。與假手術組比較，模型組大鼠出現(xiàn)大部分腎小球萎縮、纖維化，腎小囊變狹窄其壁增厚，少部分腎小球肥大，部分腎小管管腔不規(guī)則、擴張，伴隨有腎間質(zhì)有大量纖維結締組織增生；同時有較多的染色較深的炎癥細胞浸潤（圖2）。

心室肌組織HE染色后觀察切片與假手術組對比，模型組心肌細胞略變粗，排列不均勻，閏節(jié)不清晰（圖3）。

圖2 HE染色各組腎組織形態(tài)（×400）

圖3 HE染色各組心肌組織形態(tài)（×400）

3 討論

心和腎兩個重要器官之間存在非常緊密的聯(lián)系。臨床資料顯示，慢性收縮性心力衰竭患者約超過25%會合并慢性腎病，而慢性終末期腎病患者大部分合并心血管疾病且最終死亡于心力衰竭或惡性心律失常等心血管事件[9]。隨著醫(yī)療水平的不斷提高，人均壽命延長，患有心、腎疾病的病人存活率也逐年增加，從而使CRS發(fā)生率上升，因而這一臨床綜合征日益受到廣泛的關注，對CRS的早診斷和有效治療方法的探索是提高病人生存質(zhì)量的關鍵。

大鼠5/6腎切除是一種傳統(tǒng)的制作慢性腎衰動物模型的方法，隨著對心腎綜合征概念的廣泛認知，探討心腎之間復雜聯(lián)系的日益重視，這種方法逐漸被應用于慢性腎衰所致心臟改變的實驗研究中。本實驗采用大鼠5/6腎切除法復制慢性腎心綜合征動物模型，結果顯示模型組大鼠經(jīng)5/6腎切除10周后，一般狀況較差，血清肌苷、尿素氮顯著增高，其血清肌苷水平平均達146.25 μmol/L；腎血管壁增厚，管腔變小，腎小球系膜基質(zhì)增多；有較多的炎癥細胞浸潤，腎小管明顯擴張、腎小球有大部分萎縮。模型組心肌細胞變粗，排列不均勻，閏節(jié)不清晰。在CDK發(fā)展進程中，RASS的激活，以及隨著壓力負荷及容量負荷增加、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、磷鈣代謝異常、尿毒癥毒素直接毒性作用，貧血、血管內(nèi)皮功能減退、全身微炎癥環(huán)境及FGF23與TGF等信號轉(zhuǎn)導分子的復雜作用，都會導致心肌組織的損害，從而出現(xiàn)心臟結構與功能改變。

近年來觀察大鼠心臟結構、功能的方法不斷完善，如經(jīng)食道超聲心動圖測定心功能[10]等，而經(jīng)胸高頻超聲心動圖可測定心功能，還可以觀察大鼠心臟結構，而且是無創(chuàng)檢查。超聲頻率越高，近場圖像越清晰，分瓣率越高。大鼠心臟體積小，皮下深度淺，常規(guī)3.5 MHz心臟探頭無法分辨其結構，而頻率為12 MHz的高頻探頭在常規(guī)心臟超聲切面上（如胸骨旁左室長軸、左室短軸、大動脈短軸切面及心尖四腔心等）可以清晰顯示大鼠心臟結構和各瓣口血流頻譜形態(tài)[11]。據(jù)大量文獻報道高頻超聲測定的大鼠心臟指標與尸解所測得的數(shù)據(jù)高度相關[12]。因為大鼠心臟過小，如果直接在二維圖像上測量，誤差較大，所以常選擇M型曲線測量，但由于大鼠心率很快，達300～490次/min，即使在麻醉狀態(tài)下也達到200次/min以上，而常規(guī)的M型曲線掃描速度過低，二尖瓣前向血流E峰與A峰融合，難以滿意顯示大鼠左心室波群，因此本組實驗M型掃描將速度提高至200 mm/s，可以獲得較清晰的圖像，為房室大小、室壁厚度及左心室功能的準確測量提供了保證。本實驗檢測結果顯示，室間隔舒張期厚度（IVSd）、室間隔收縮期厚度（IVSs）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVTDs）無明顯變化。據(jù)張曉芳[13]的報道，持續(xù)17周后，模型組大鼠左室舒張末期后壁厚度（LVPWd）、左室舒張末期前壁厚度（LVAWd）和校正后的左室質(zhì)量（LV Mass）有明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。本實驗僅持續(xù)10周時間，因此隨著時間的延長，存活大鼠的心臟結構改變更為顯著。但本實驗中模型組大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）已有顯著增加，左室射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）顯著降低?？傊?，高頻超聲心動圖可以較準確地診斷大鼠心臟結構功能的變化，但大鼠前胸壁隆起，且心臟體積小，探頭放置易不穩(wěn)，因此對檢查人員的操作水平要求較高，只有操作熟練，手法穩(wěn)當，且能熟練調(diào)試儀器的人員才能獲得清晰的圖像。

4 結 論

本實驗通過5/6腎切除，成功建立了慢性腎心綜合征大鼠模型；經(jīng)胸高頻超聲心動圖可以較好地顯示大鼠心臟，得到滿意的超聲心動圖，且安全無創(chuàng)，能較好地評價慢性腎心綜合征大鼠心臟結構和功能的變化，可供基礎與臨床研究借鑒。

1. Bongartz LG，Cramer MJ，Doevendans PA，et al.The severe cardiorenal syndrome:'Guyton revisited'[J].Eur Heart J，2005，26（1）:11-17.

2. Granata A，Clementi A，Virzi GM，et al.Cardiorenal syndrome type 4:From chronic kidney disease to cardio?vascular impairment[J].Eur J Intern Med，2016，30（5）:1-6.

3. Samak MJ，Levey AS，Schoolwerth AC，et al.Kidney disease as a risk factor for development of cardiovascular disease:a statement from the american heart association councils on kidney in cardiovascular disease，high blood pressure research，clinical cardiology，and epidemiology and prevention[J].Hypertension，2003，42（5）:1 050-1 065.

4. Kazory A.Fluid overload as a major target in management of cardiorenal syndrome:Implications for the practice of peritoneal dialysis[J].World J Nephrol，2017，6（4）:168-175.

5. 沈延春，楊曉，陳瓊霞.5/6腎切除大鼠腎臟病理學動態(tài)變化[J].上海實驗動物科學，2005，25（1）:21-24.

6. 王晶晶，陳丁丁.5/6腎切除腎衰大鼠致心腎綜合癥模型的實驗研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2009，3（15）:1-4.

7. 王紅鵠，楊軍，白洋，等.超聲心動圖評價肺動脈高壓大鼠右心結構和功能的動態(tài)變化[J].中國醫(yī)學影像技術，2015，31（1）:3-8.

8. 閆軍，鄭敏，朱芳芳.超聲心動圖評價酒精性心肌病大鼠心臟結構和功能的實驗研究[J].臨床超聲醫(yī)學雜志，2012，14（2）:73-76.

9. Andrukonis K，Bell CL.Cardiorenal syndrome under?standing the connections between cardiac and renal disease[J].JAAPt，2014，27（2）:12-17.

10. Song CL，Liu B，Diao HY，et al.The protective effect of microRNA-320 on left ventricular remodeling after myocardial ischemia-reperfusion injury in the rat model[J].Int J Mol Sci，2014，15（10）:17 442-17 456.

11. 張敏莉，李昭屏，白燕，等.超聲心動圖評價容量負荷心臟肥大大鼠模型[J].中國醫(yī)學影像技術，2007，23（11）:1 593-1 596.

12. 朱文暉，張曉紅，肖淵茗，等.超聲心動圖評價心力衰竭大鼠模型心功能改變[J].中南大學學報:醫(yī)學版，2009，34（5）:453-456.

13. 張曉芳.大鼠5/6腎切除誘發(fā)心臟毒性動物模型的建立及應用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（3）:474.