李 根，尹甲偉，王麗娟，車峰遠(yuǎn),4，衡雪源

膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]。膠質(zhì)瘤的病理分類十分復(fù)雜，分為星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、多形膠母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、少枝膠母細(xì)胞瘤等。WHO分類將膠質(zhì)瘤分為I～I(xiàn)V四個(gè)級(jí)別[2]。近年來，盡管手術(shù)切除、放療及化療等治療手段取得了一定的效果，膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)依然活躍，治療效果仍然較差。因手術(shù)難以完全根除腫瘤床周邊的腫瘤組織，術(shù)后腫瘤容易在原腫瘤周圍組織復(fù)發(fā)，且對(duì)放療及化療也不敏感[3-4]。高級(jí)別（III～I(xiàn)V級(jí)）膠質(zhì)瘤預(yù)后很差，患者生存期短，死亡率較高[2,5]。所以，迫切需要研究新的治療方法，提高膠質(zhì)瘤的治療療效，控制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生存期。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)存在一類細(xì)胞，這類細(xì)胞具有無限增殖、自我更新及多向分化等能力，稱為腫瘤干細(xì)胞[6]。腫瘤干細(xì)胞對(duì)常規(guī)放療和化療不敏感。據(jù)報(bào)道，膠質(zhì)瘤內(nèi)也存在這類腫瘤干細(xì)胞[7]。膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞通常表達(dá)CD133分子[8]。而且，膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展、化療耐藥、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[9]。因此，消滅膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞是治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵。

近年來，腫瘤免疫治療已成為研究的熱點(diǎn)。人們對(duì)于膠質(zhì)瘤免疫治療的關(guān)注也日益增多。腫瘤免疫治療結(jié)合其他治療策略可能為膠質(zhì)瘤患者帶來新的希望。目前，已有臨床試驗(yàn)研究證實(shí)，抗腫瘤特異性抗原的活性疫苗能有效地治療膠質(zhì)瘤[10-11]。本研究建立了膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞株，并對(duì)其殺傷功能進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251及SF295分別購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫和凱基生物。DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司（Hyclone,Los Angeles,CA,USA），T細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶消化液、L-谷氨酰胺、B27（50×）、青霉素-鏈霉素雙抗及胎牛血清購自Gibco公司（Gibco,Grand Island,NY,USA），膠原酶D購自Roche公司（Roche,Basel,Switzerland），表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及白血病抑制因子購自Pe?proTech公 司（PeproTech,USA），CD3及 CD133 MACS kit購自Miltenyi Biotec公司（Miltenyi Biotec,Teterow，Germany），IL-2、IL-7及IL-15購自R&D公司（R&D,MA,USA），同型對(duì)照（isotype control）、CD133、CD107a、IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素流式抗體購自eBioscience公司（eBioscience,San Diego,USA）。

1.2 方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)及CD133+膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的獲得

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，胰酶消化成單細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基（含DMEM/F12、B27 1×、表皮生長(zhǎng)因子20 ng/mL、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20 ng/mL，白血病抑制因子10 ng/mL、L-谷氨酰胺1×）培養(yǎng)。每隔3～4 d更換一次新鮮無血清培養(yǎng)基，約1周后可見細(xì)胞成球生長(zhǎng)，獲得足夠數(shù)量膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞球，通過磁珠分選方法，分離并獲得膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞。

1.2.2 建立膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞株

從健康供者外周血中分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選獲得CD3+T細(xì)胞。輻照過的膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)并與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d為一個(gè)周期。共培養(yǎng)7 d后，收集T細(xì)胞，繼續(xù)加入輻照過的膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞，共培養(yǎng)體系中加入IL-2(10 IU/mL)、IL-7(5 ng/mL)和IL-15(5 ng/mL)。反復(fù)誘導(dǎo)和共培養(yǎng)T細(xì)胞四個(gè)周期，建立膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞株。

1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)：收集細(xì)胞，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，加入流式抗體，避光孵育30 min，洗滌細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀(FACS Canto;BD Biosciences)檢測(cè)，使用Flow Jo軟件分析結(jié)果。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿膜，其余操作步驟同表面蛋白檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞表達(dá)CD133

首先，使用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF 295誘導(dǎo)生成膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞。其次，通過流式細(xì)胞學(xué)，檢測(cè)膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞CD133分子的表達(dá)水平。如圖1所示，膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞表達(dá)CD133。

圖1 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞CD133的表達(dá)

2.2 膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)IFN-及CD107a

IFN-及CD107a常用作細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的標(biāo)記。我們使用膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞作為靶細(xì)胞，誘導(dǎo)刺激并建立膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞株。使用膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞重復(fù)刺激膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞后，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN-及CD107a。因此，膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞具有細(xì)胞毒性殺傷作用。

圖2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞IFN-及CD107a的表達(dá)

2.3 膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)穿孔素及顆粒酶B

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮殺傷功能的主要機(jī)制有：通過釋放穿孔素和顆粒酶及通過Fas/FasL通路誘導(dǎo)的凋亡。膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞通過流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)穿孔素和顆粒酶B。因此，膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞通過穿孔素/顆粒酶通路殺傷膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞。

圖3 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞穿孔素及顆粒酶B的表達(dá)

3 討論

免疫系統(tǒng)的作用是識(shí)別危險(xiǎn)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)宿主免受感染及惡性腫瘤等的攻擊。腫瘤未經(jīng)治療時(shí)，處于發(fā)展及持續(xù)進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，這主要是因?yàn)槿狈γ庖呦到y(tǒng)的監(jiān)視。腫瘤免疫療法的目的是利用免疫系統(tǒng)的固有能力來識(shí)別和殺死惡性腫瘤細(xì)胞，與傳統(tǒng)化療相比，腫瘤免疫治療特異性強(qiáng)，毒副反應(yīng)小[12]。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，由于血腦屏障的存在，大腦是一個(gè)免疫豁免的區(qū)域[13-14]。目前，越來越多的研究認(rèn)為，大腦內(nèi)存在免疫應(yīng)答反應(yīng)。大腦組織或器官內(nèi)的一些細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這為膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了基礎(chǔ)[15-16]。膠質(zhì)瘤免疫治療主要是使用腫瘤細(xì)胞或其組成成分合成疫苗和具有合成肽段的疫苗[17]。許多隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示疫苗治療效果較好，但還不能提高患者的生存率[12]。惡性膠質(zhì)瘤免疫治療的主要障礙是腫瘤導(dǎo)致的免疫抑制。腫瘤免疫抑制的機(jī)制涉及多種因素包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，腫瘤PD-L1的表達(dá)，和CTLA-4信號(hào)。目前已有一些免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤[12]。第二種免疫治療策略是T細(xì)胞免疫治療。通過高親和力的T細(xì)胞受體或抗腫瘤抗體，使用患者自身的淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)生成腫瘤特異性反應(yīng)T細(xì)胞[17]。T細(xì)胞免疫治療的優(yōu)點(diǎn)主要是修飾細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞的活性、體內(nèi)持久性及對(duì)腫瘤免疫抑制環(huán)境的抵抗力[17]。膠質(zhì)瘤免疫治療的前景可能在于主動(dòng)免疫接種和免疫檢查點(diǎn)抑制相結(jié)合。

4 結(jié)論

在本研究中，我們首次成功建立了膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞株。而且，研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤CD133+腫瘤干細(xì)胞具有殺傷功能，這種殺傷作用主要通過穿孔素/顆粒酶通路介導(dǎo)。

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