周瑤琴，游鳳，鐘杰，王豪舉，丁紅雷

西南大學(xué) 獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715

豬支原體肺炎 (Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS) 是由豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) 引起的一種慢性、接觸性呼吸道傳染病，廣泛分布于世界各地[1]。我國(guó)每年由此病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò) 100億元[2]。現(xiàn)階段我國(guó)大部分豬場(chǎng)使用MPS滅活疫苗，還有部分豬場(chǎng)使用弱毒疫苗控制MPS。這些疫苗能夠在一定程度減輕臨床癥狀和肺部病理?yè)p傷[3-4]，提高日增重[4]，但其免疫保護(hù)效果和人們的期望仍有差距[5-6]?；蚬こ桃呙缡俏磥?lái) MPS疫苗的一個(gè)發(fā)展方向?；蚬こ桃呙绫Ｗo(hù)性抗原的篩選通常采用體外表達(dá)純化病原蛋白后再免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或宿主，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或宿主的免疫學(xué)指標(biāo)和評(píng)價(jià)蛋白抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或宿主的免疫保護(hù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種方法工作量大，花費(fèi)不菲，且對(duì)抗原的選擇盲目性很大，抗原篩選的成功率不高[7]。

若能在病原菌基因組編碼的所有蛋白信息基礎(chǔ)上，高通量大規(guī)模鑒定疫苗蛋白抗原，則能夠降低因只關(guān)注某幾個(gè)潛在抗原蛋白而造成抗原篩選的遺漏和偏差，增加基因工程疫苗研發(fā)成功的概率和提高疫苗免疫保護(hù)效果。建立快速鑒定Mhp免疫顯性抗原的方法在高通量大規(guī)模鑒定MPS疫苗候選蛋白抗原工作中十分必要，這在很大程度上能夠減少抗原篩選的工作量，加快工作進(jìn)度。

Mhp366是一種能夠在Mhp自然感染條件下，刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈體液免疫的蛋白[8]。本研究以Mhp366蛋白為例，建立了一種基于間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Indirect enzyme-linked immunosorbent assay，Indirect ELISA) 原理的快速鑒定Mhp血清體液免疫顯性蛋白抗原的方法，并用 Mhp156和 Mhp364蛋白驗(yàn)證了該方法的有效性[9]。該方法的建立能夠在基因組水平高通量篩選 Mhp血清體液免疫顯性蛋白抗原，并為Mhp初乳體液免疫和粘膜免疫顯性蛋白抗原鑒定方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 BL21(DE3)、大腸桿菌 XL-1 Blue感受態(tài)和pGEX-6P-1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

mhp366、mhp364和mhp156基因由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。在合成時(shí)將mhp366中第 835–837、967–969、1224–1226 和1312–1314 位，mhp364中第 676–678、979–981、1456–1458 位，mhp156中第 133–135、169–171、193–195、235–237、256–258 位 TGA 密碼子修改為TGG。合成的基因連接pGEX-6P-1載體，構(gòu)建pGEX-6P-1-mhp366、pGEX-6P-1-mhp364、pGEX-6P-1-mhp156重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。

1.2 血清

Mhp陽(yáng)性豬場(chǎng)血清采集自重慶市和四川省兩個(gè)豬場(chǎng)具有咳嗽、氣喘等典型豬支原體肺炎臨床癥狀的豬，共35份。這兩個(gè)豬場(chǎng)的豬群在寒冷季節(jié)和氣候驟變時(shí)表現(xiàn)出明顯的 MPS臨床癥狀；Mhp陰性血清采集自貴州省某豬場(chǎng)，共30份。該豬場(chǎng)具有良好的管理模式，豬群沒(méi)有MPS臨床癥狀，在過(guò)去兩年的血清學(xué)監(jiān)測(cè)中，Mhp抗體均為陰性。同時(shí)采集對(duì)應(yīng)的豬的支氣管肺泡灌洗液。

1.3 主要試劑和菌株

核酸marker購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自 Omega公司。BamHⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、蛋白 marker購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。谷胱甘肽瓊脂糖珠購(gòu)自GE Healthcare公司。谷胱甘肽包被板、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG、胎牛血清 (FBS) 購(gòu)自Thermo Scientific公司。豬肺炎支原體抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。ELISA底物液A、B和終止液購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司。鼠抗GST-Tag單抗購(gòu)自Bioworld公司。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自Proteintech公司。PVDF膜購(gòu)自Roche Diagnostics公司。eECL購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。PreScission Protease由第三軍醫(yī)大學(xué)微生物與生化藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)與純化

提取大腸桿菌DH5α中的pGEX-6P-1-mhp366、pGEX-6P-1-mhp364和pGEX-6P-1-mhp156質(zhì)粒，pGEX-6P-1-mhp366和 pGEX-6P-1-mhp364經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，pGEX-6P-1-mhp156經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確后，pGEX-6P-1-mhp366、pGEX-6P-1-mhp364轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，pGEX-6P-1-mhp156轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1 Blue感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組子，分別再次經(jīng)BamHⅠ+XhoⅠ、BamHⅠ+XhoⅠ以及BamHⅠ+SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的重組菌分別命名為GST-Mhp366重組菌、GST-Mhp364重組菌和GST-Mhp156重組菌。

GST-Mhp366重組菌、GST-Mhp364重組菌和GST-Mhp156重組菌分別接種于含100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.7–0.9時(shí)，加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，GST-Mhp366和GST-Mhp364 30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白4 h，GST-Mhp156 16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白20 h。收集菌液，4 ℃、5 000 r/min離心15 min。棄上清后加入細(xì)菌裂解液 (PBS中加入1% Triton X-100、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、75 IU/mL抑肽酶、20 μmol/L亮肽素、1.6 μmol/L抑肽素，pH 7.2)，超聲 (220 V、110 W) 破碎細(xì)菌30次 (工作 3 s，間歇 4 s)。4 ℃、13 000 r/min 離心 15 min，取上清，與谷胱甘肽瓊脂糖珠室溫旋轉(zhuǎn) (25 r/min)孵育1 h，經(jīng)PBST洗滌2次和PBS洗滌1次后離心。沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

與谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育結(jié)合的蛋白加入適量PBS和PreScission Protease，室溫酶切5 h，4 ℃、10 000 r/min離心1 min，取上清；在沉淀中再次加入適量 PBS，振蕩后再次離心取上清，如此重復(fù)2次。將上清液和剩余的沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化情況。

pGEX-6P-1載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒鑒定，該基因工程菌命名為GST工程菌，作為陰性對(duì)照。其誘導(dǎo)表達(dá)溫度和IPTG濃度同GST-Mhp366重組菌。

1.5 重組蛋白的鑒定

將純化的 GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156蛋白進(jìn)行 Western blotting鑒定。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉的TBST封閉 2 h，TBST洗滌 3次，每次 5 min；鼠抗GST-Tag單抗 (1∶8 000稀釋) 室溫孵育 1 h，TBST洗滌3次，每次5 min；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶20 000稀釋) 室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，eECL顯色。

1.6 Mhp陽(yáng)性血清和陰性血清的準(zhǔn)備

Mhp陽(yáng)性豬場(chǎng)血清和陰性豬場(chǎng)血清經(jīng)Mhp抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，支氣管肺泡灌洗液經(jīng)套式PCR檢測(cè)[10]。在Mhp陽(yáng)性豬場(chǎng)中隨機(jī)選取17份Mhp抗體陽(yáng)性和核酸陽(yáng)性豬血清，在Mhp陰性豬場(chǎng)中隨機(jī)選取13份Mhp抗體陰性和核酸陰性豬血清。

GST工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后制備細(xì)菌裂解液，按GST細(xì)菌裂解液∶血清=1∶50的比例加入Mhp陽(yáng)性血清/陰性血清，4 ℃過(guò)夜旋轉(zhuǎn) (25 r/min)孵育，對(duì)血清進(jìn)行預(yù)吸附。

1.7 最佳抗原包被濃度的選擇

GST-Mhp366重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后離心，加入細(xì)菌裂解液超聲破碎，25 mL菌液對(duì)應(yīng)1 mL細(xì)菌裂解液，4 ℃、13 000 r/min離心15 min去除細(xì)胞碎片。細(xì)菌裂解液按原液、1∶5、1∶10比例稀釋后，谷胱甘肽包被板每孔加入200 μL，4 ℃包被過(guò)夜，PBST洗滌5次，每次 3 min。加入 200 μL含0.25%脫脂奶粉和10% FBS的PBS作為封閉液室溫封閉1 h，PBST洗滌5次，每次3 min。將豬血清用封閉液按1∶500比例稀釋后，每孔加入100 μL，室溫孵育2 h，PBST洗滌5次，每次3 min。HRP標(biāo)記兔抗豬IgG用封閉液1∶40 000比例稀釋后，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5 次，每次3 min。每孔加入底物液A和底物液B各50 μL，混勻，室溫避光顯色10 min后加入50 μL終止液，10 min內(nèi)酶標(biāo)儀測(cè)定OD630值。

GST工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后按GST-Mhp366重組菌條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測(cè)定相應(yīng)孔的OD630值。

1.8 最佳封閉液的確定

按已確定的GST-Mhp366重組菌和GST工程菌的最佳細(xì)菌裂解液濃度加入谷胱甘肽包被板，分別以PBS+10% FBS、PBS+2.5%脫脂奶粉、PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉封閉，每孔加入200 μL，室溫封閉1 h，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測(cè)量相應(yīng)孔的OD630值。

1.9 最佳血清稀釋度和最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定

按已確定的GST-Mhp366重組菌和GST工程菌的最佳細(xì)菌裂解液濃度加入谷胱甘肽包被板，使用最佳封閉液進(jìn)行封閉。血清按 1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000稀釋，HRP標(biāo)記兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗按照1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000稀釋。測(cè)量相應(yīng)孔的OD630值。

1.10 間接ELISA反應(yīng)條件的判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)不同的反應(yīng)條件進(jìn)行間接 ELISA。GST-Mhp366細(xì)菌裂解液和GST細(xì)菌裂解液分別與13份 Mhp陰性血清反應(yīng)，計(jì)算 GST-Mhp366細(xì)菌裂解液和GST細(xì)菌裂解液與每份陰性血清反應(yīng)的OD630值之差，該差值的平均值為x，標(biāo)準(zhǔn)差為s，將+2s所得的值定為用Mhp366蛋白判定陰陽(yáng)血清的界限。

GST-Mhp366細(xì)菌裂解液和GST細(xì)菌裂解液分別與 17份 Mhp陽(yáng)性血清反應(yīng)。同理，計(jì)算GST-Mhp366細(xì)菌裂解液和GST細(xì)菌裂解液與每份陽(yáng)性血清反應(yīng)的OD630值之差，該差值命名為A。若A≥+2s，則判定為Mhp366抗體陽(yáng)性。選擇A值≥+2s對(duì)應(yīng)的血清數(shù)量最多的反應(yīng)條件，確定為 Mhp血清體液免疫顯性蛋白抗原ELISA的最佳反應(yīng)條件。

1.11 間接ELISA方法的驗(yàn)證

GST-Mhp364重組菌和 GST-Mhp156重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體，加入細(xì)菌裂解液超聲破碎，25 mL菌液對(duì)應(yīng)1 mL細(xì)菌裂解液，離心去除細(xì)胞碎片。用GST-Mhp366蛋白建立的間接ELISA反應(yīng)條件[9]檢測(cè) Mhp364抗體陽(yáng)性血清數(shù)量和Mhp156抗體陽(yáng)性血清數(shù)量。若某蛋白抗體陽(yáng)性血清數(shù)量超過(guò)Mhp陽(yáng)性血清數(shù)量的一半，則將該蛋白判定為血清體液免疫顯性蛋白抗原。

2 結(jié)果與分析

2.1 GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156和GST蛋白的原核表達(dá)、純化與鑒定

提取 GST-Mhp366、GST-Mhp364和 GSTMhp156重組菌中的重組質(zhì)粒，分別經(jīng)雙酶切后，得到4 984 bp的載體片段和3個(gè)載體中的1 668 bp、1 599 bp、1 062 bp 的mhp366、mhp364、mhp156基因片段 (圖1)。所有片段和預(yù)期條帶大小相符，說(shuō)明 pGEX-6P-1-mhp366、pGEX-6P-1-mhp364、pGEX-6P-1-mhp156重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并在大腸桿菌BL21(DE3)/XL-1 Blue中成功轉(zhuǎn)化。GST重組菌中也能提取出大小約5 000 bp的質(zhì)粒，說(shuō)明pGEX-6P-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)成功。

GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156重組菌經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后超聲破菌，以13 000 r/min離心取上清檢測(cè)蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由于包涵體蛋白12 000 ×g離心后沉淀[11]，因此，3個(gè)重組蛋白均能夠以可溶形式表達(dá)。

經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖珠吸附的GST-Mhp366破菌上清SDS-PAGE后可見在90 kDa和26 kDa處各有一條明顯的條帶 (圖2，第1泳道)。90 kDa處為與預(yù)期蛋白大小相同的GST-Mhp366融合表達(dá)蛋白，26 kDa處為 GST蛋白。融合蛋白經(jīng)PreScission Protease酶切后，得到約 70 kDa的Mhp366 (圖 2，第2、3、4、5泳道)，比預(yù)期蛋白大小 (64 kDa) 偏大。經(jīng)酶切之后的谷胱甘肽瓊脂糖珠-融合蛋白復(fù)合物中仍有未被酶切的融合蛋白、被酶切的Mhp366蛋白、GST蛋白和46 kDa的PreScission Protease (圖2，第6泳道)。

經(jīng)吸附的GST-Mhp364破菌上清電泳后可見與預(yù)期蛋白大小相同的87 kDa GST-Mhp364融合蛋白和26 kDa GST蛋白 (圖2，第7泳道)，經(jīng)PreScission Protease酶切后，得到61 kDa與預(yù)期蛋白大小相同的Mhp364 (圖2，第8、9、10、11泳道)。經(jīng)酶切之后的谷胱甘肽瓊脂糖珠-融合蛋白復(fù)合物中仍有未被酶切的融合蛋白、被酶切的Mhp364蛋白、GST蛋白和46 kDa的PreScission Protease (圖 2，第 12泳道)。

圖 1 pGEX-6P-1-mhp366、pGEX-6P-1-mhp364、pGEX-6P-1-mhp156重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant plasmids pGEX-6P-1-mhp366, pGEX-6P-1-mhp364 and pGEX-6P-1-mhp156 by double enzyme digestion. M: DNA marker Ⅲ; Lane 1:pGEX-6P-1-mhp366 was digested with BamHⅠ and XhoⅠ. Lane 2: pGEX-6P-1-mhp364 was digested with BamHⅠ and XhoⅠ. Lane 3: pGEX-6P-1-mhp156 was digested with BamHⅠ and SalⅠ.

圖2 GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156重組蛋白表達(dá)純化及蛋白酶切分析的電泳圖Fig. 2 Recombinant proteins GST-Mhp366, GST-Mhp364 and GST-Mhp156 were purified by Glutathione SepharoseTM 4B and digested by PreScission Protease. M: protein molecular weight marker; 1: GST-Mhp366 fusion protein; 2: the Mhp366 supernatant was harvested after the cleavage; 3–5: the Mhp366 beads were sequentially washed three times with PBS; 6: the remaining Mhp366 bead sample after digestion and washing; 7: GST-Mhp364 fusion protein; 8: the Mhp364 supernatant was harvested after the cleavage; 9–11: the Mhp364 beads were sequentially washed three times with PBS; 12: the remaining Mhp364 bead sample after digestion and washing; 13: GST-Mhp156 fusion protein; 14: the Mhp156 supernatant was harvested after the cleavage; 15–17: the Mhp156 beads were sequentially washed three times with PBS; 18: the remaining Mhp156 bead sample after digestion and washing.

經(jīng)吸附的GST-Mhp156破菌上清電泳后可見與預(yù)期蛋白大小相同的62 kDa GST-Mhp156融合蛋白和26 kDa GST蛋白 (圖2，第13泳道)，經(jīng)PreScission Protease酶切后，得到 36 kDa的Mhp156 (圖 2，第 14、15、16、17 泳道)，與預(yù)期蛋白大小相同。該蛋白極易降解。經(jīng)酶切之后的谷胱甘肽瓊脂糖珠-融合蛋白復(fù)合物中仍有未被酶切的融合蛋白、被酶切的Mhp156蛋白、GST蛋白和46 kDa的PreScission Protease (圖2，第18泳道)。

圖2泳道1–18中的雜帶為非特異結(jié)合在谷胱甘肽瓊脂糖珠的雜蛋白。

用抗GST標(biāo)簽單抗進(jìn)行Western blotting，結(jié)果表明GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156融合蛋白大小分別為90、87、62 kDa (圖3)，均與預(yù)期大小相符，進(jìn)一步表明這3個(gè)重組蛋白均成功表達(dá)。

2.2 間接ELISA反應(yīng)條件的確定

2.2.1 最佳抗原包被濃度的選擇

GST-Mhp366和GST細(xì)菌裂解液原液按1∶5、1∶10比例稀釋后進(jìn)行抗原包被，原液和按1∶5稀釋時(shí) A≥+2s對(duì)應(yīng)的 Mhp366抗體陽(yáng)性血清數(shù)最多 (圖4)?？紤]到在今后Mhp血清免疫顯性蛋白抗原的篩選試驗(yàn)中，部分重組蛋白抗原的表達(dá)量可能低于GST-Mhp366重組菌中重組蛋白的表達(dá)量，因此將細(xì)菌裂解液原液作為最佳抗原包被濃度。

圖3 GST-Mhp366、GST-Mhp364、GST-Mhp156重組蛋白進(jìn)行Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of recombinant proteins GST-Mhp366, GST-Mhp364 and GST-Mhp156. M:precision Plus Protein? Dual Color Standards; 1: GSTMhp366 fusion protein; 2: GST-Mhp364 fusion protein;3: GST-Mhp156 fusion protein.

圖4 抗原最佳包被濃度的選擇Fig. 4 Optimization for the concentration of coating antigen with indirect ELISA.

2.2.2 最佳封閉液的確定

以最佳抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，選用PBS+10% FBS、PBS+2.5%脫脂奶粉、PBS+10%FBS+2.5%脫脂奶粉3種封閉液比較封閉效果，結(jié)果顯示PBS+10% FBS+2.5%脫脂奶粉作為封閉液進(jìn)行ELISA，A值≥+2s對(duì)應(yīng)的Mhp366抗體陽(yáng)性血清數(shù)最多 (圖5)。因此選擇PBS+10% FBS+2.5%脫脂奶粉作為封閉液。

2.2.3 最佳血清稀釋度和最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定

血清1∶500稀釋，酶標(biāo)二抗1∶40 000、1∶80 000稀釋時(shí)均有16個(gè)Mhp366抗體陽(yáng)性血清，因此選擇血清1∶500稀釋為最佳血清稀釋度；考慮到酶標(biāo)二抗稀釋度越高試驗(yàn)誤差越大，因此將酶標(biāo)二抗按照1∶40 000稀釋作為最佳工作濃度 (圖6)。

2.2.4 間接ELISA方法的驗(yàn)證

采用本試驗(yàn)建立的方法，GST-Mhp364和GSTMhp156重組菌裂解液分別與17份Mhp抗體陽(yáng)性血清和13份抗體陰性血清反應(yīng)后，Mhp364抗體陽(yáng)性血清有9份，Mhp156抗體陽(yáng)性血清有12份，二者的抗體陽(yáng)性血清數(shù)量均超過(guò)所用Mhp抗體陽(yáng)性血清數(shù)量的一半。因此，Mhp364和Mhp156蛋白均為血清體液免疫顯性蛋白抗原，這與Simionatto等報(bào)道的結(jié)果一致 (Mhp364和Mhp156在7 448株中編號(hào)分別為MHP0353和MHP0223)[9]。

圖5 最佳封閉液的確定Fig. 5 Optimization of blocking buffer.

圖6 最佳血清稀釋度和最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定Fig. 6 Determination of optimal dilution of serum and HRP-conjugated IgG.

3 討論

本研究中的 Mhp366蛋白在自然感染菌株中能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)；體外無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)量很低，幾乎不能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，也幾乎不與Mhp高免血清發(fā)生反應(yīng)[8]。因此，本研究以 Mhp366蛋白為基礎(chǔ)，建立篩選豬肺炎支原體血清體液免疫顯性蛋白抗原方法。

在真核生物和大部分原核生物中色氨酸由TGG編碼，在支原體中色氨酸由TGA編碼[12]。TGA在真核生物和大部分原核生物中編碼終止密碼子。在mhp366、mhp364、mhp156中，分別有4個(gè)、3個(gè)、5個(gè)編碼色氨酸的TGA密碼子。因此，若在大腸桿菌中表達(dá) Mhp366、Mhp364、Mhp156蛋白，需要將TGA突變?yōu)門GG。考慮到PCR擴(kuò)增mhp366、mhp364和mhp156后再將TGA密碼子突變?yōu)門GG，工作量很大，因此，本研究直接合成了3個(gè)基因，并將TGA密碼子直接修改為TGG。

本試驗(yàn)采用 pGEX-6P-1載體連接mhp366、mhp364、mhp156基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒。因?yàn)閜GEX-6P-1載體含有GST基因，重組菌表達(dá)的GST蛋白具有極強(qiáng)的親水性，和 Mhp366、Mhp364、Mhp156分別形成融合蛋白后能最大限度地保證融合蛋白以具有天然構(gòu)象的可溶形式表達(dá)[12]。另外GST蛋白能和商品化谷胱甘肽包被板上的谷胱甘肽形成特異性硫鍵共價(jià)結(jié)合，間接地包被了目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的快速包被。不同重組菌目的蛋白的表達(dá)量存在差別，為了能夠飽和包被板上的谷胱甘肽[13]，采用重組菌裂解液原液來(lái)包被谷胱甘肽板。

我們采用重組菌裂解液包被ELISA的結(jié)果減去GST工程菌裂解液包被ELISA的結(jié)果，減少重組菌中由于非特異結(jié)合形成的背景值。另外在ELISA之前，我們還用GST工程菌裂解液吸附了血清中可能存在的GST抗體和一些其他病原感染豬形成的抗體，特別是環(huán)境中大量存在的大腸桿菌蛋白抗體，最大限度降低了血清的背景值，其結(jié)果優(yōu)于不使用GST工程菌裂解液吸附。

傳統(tǒng)的蛋白抗原篩選通常是通過(guò)純化蛋白后免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)價(jià)抗原的免疫應(yīng)答和對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫保護(hù)作用[14]。許多Mhp外膜蛋白也作為疫苗候選抗原用于免疫小鼠，并對(duì)相應(yīng)的免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)[15-17]。但抗原對(duì)小鼠的免疫應(yīng)答不能代表抗原對(duì)豬的免疫應(yīng)答，更重要的是這種免疫應(yīng)答不能代表對(duì)豬的免疫保護(hù)。反向疫苗學(xué)技術(shù)為疫苗抗原的篩選提供了全新的思路，可以基于微生物學(xué)基因組編碼的所有蛋白，通過(guò)與感染病原的本動(dòng)物血清反應(yīng)，篩選具有高免疫反應(yīng)性的普遍存在于病原的保守蛋白抗原[9,18]，但這些方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。已有實(shí)驗(yàn)室采用反向疫苗學(xué)方法，利用谷胱甘肽包被板與攜帶GST標(biāo)簽的沙眼衣原體重組蛋白結(jié)合，篩選免疫顯性蛋白抗原，建立了沙眼衣原體免疫顯性抗原組[19-21]，該實(shí)驗(yàn)室還利用此方法篩選了肺炎衣原體[22]和鼠衣原體[23-24]免疫顯性蛋白抗原。那么，這種方法能否用于Mhp免疫顯性蛋白抗原的檢測(cè)？本試驗(yàn)在可溶表達(dá)GST-Mhp366重組蛋白基礎(chǔ)上，將重組菌細(xì)胞裂解液與谷胱甘肽包被板結(jié)合，直接與本動(dòng)物血清反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Mhp366蛋白幾乎能與所有Mhp陽(yáng)性血清反應(yīng) (16/17)，證明了Meens等的結(jié)果[8]，并以此建立了一種快速鑒定Mhp血清體液免疫顯性蛋白抗原的方法。

Mhp364和Mhp156是兩個(gè)能夠在體外和體內(nèi)表達(dá)、高度保守[25]且在自然感染條件下刺激豬產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的Mhp蛋白[9]。本研究進(jìn)一步用Mhp364和Mhp156驗(yàn)證了所建立篩選方法的有效性，這為Mhp基因工程疫苗蛋白抗原的篩選提供了有效的研究方法。今后將對(duì)Mhp蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，并用此方法大規(guī)模篩選Mhp血清體液免疫顯性蛋白抗原。

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