王輝，楊波，趙可勝，李家吉，李新，孔萌萌，宮春杰，王毅，陶冶，張秋，胡征

湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068

卡他莫拉菌 (Moraxella catarrhalis,Mc) 由Kirchner首次分離于1890年，當時稱之為卡他微球菌Micrococcus catarrhalis[1]，之后又稱為卡他奈瑟菌Neisseria catarrhalis和卡他布蘭漢菌Branhamella catarhalis。最初被認為是對人體無致病性的上呼吸道正常寄居菌，后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅可以引起兒童和老年人的上呼吸道感染，而且還是引起兒童上頜竇炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的最常見致病菌[2-6]。因多數(shù)分離株具有 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性[7-16]，所以需要確診后再選擇合適的治療方案。但臨床上該菌與其他呼吸道病原體引起的感染癥狀類似，因此常難以根據(jù)臨床表現(xiàn)、X-射線檢查等得出結(jié)論，確診往往依賴于實驗室診斷。由于兒童疾病起病急、轉(zhuǎn)歸快的特點，要求建立基于抗原的敏感、快速、實用的病原體檢測方法，因此尋找制備方法簡便、特異性高的針對性抗體具有重要意義。

普遍存在的表面蛋白 (Ubiquitous surface protein A，UspA) 又稱為高分子量外膜蛋白，是Mc外膜蛋白中研究較成熟的蛋白。1994年，Helminen等[17]發(fā)現(xiàn)M. catarrhalisO35E菌株UspA蛋白表面暴露區(qū)存在單克隆抗體 (MAb 17C7)識別位點。此后，該蛋白被廣泛報道。1997年，Aebi等[18]發(fā)現(xiàn) UspA蛋白包括 2種蛋白分子，uspa1編碼蛋白的UspA1 (88 kDa) 和uspa2編碼的UspA2 (62 kDa)。兩者均含MAb 17C7識別位點，分別存在相似性達 93%的氨基酸序列片段(由140個氨基酸組成)。1998年，Aebi等[19]證明UspA1蛋白在Mc黏附到上皮細胞過程中起作用，而 UspA2蛋白存在時宿主血清殺菌能力受到限制。Mcmichael等[20]報道，UspA1和UspA2為不同的毒力功能服務(wù)，但都有很好的免疫原性和反應(yīng)原性。Chen等[21]報道抗UspA1抗體和抗UspA2抗體有交叉反應(yīng)，兩者都與免疫血清的殺菌活性有關(guān)。Lafontaine等[22]發(fā)現(xiàn)UspA1蛋白和由基因uspA2H編碼的UspA2H蛋白共同調(diào)節(jié)Mc對人上皮細胞的黏附。Meier等[23]報道外膜蛋白 UspA1和 UspA2在幼兒咽炎分離株中高度保守。Hays等[24]認為UspA1和UspA2可作為疫苗候選抗原。Murphy等[25]認為UspA1和UspA2可作為抗體的靶標。由此可見，UspA1和UspA2具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可用于抗體的制備。

然而，該蛋白在卡他莫拉菌內(nèi)表達量較少，提取天然蛋白后制備抗體存在困難。目前，國內(nèi)外未見用 UspA1重組蛋白制備多克隆抗體的報道。本研究通過對UspA1蛋白進行生物信息學分析，獲取了胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，并對其密碼子進行原核優(yōu)化后獲得了經(jīng)修飾的uspa1基因。通過全基因合成和分子克隆技術(shù)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-uspa1，經(jīng)過誘導(dǎo)表達及純化獲得重組蛋白 UspA1-His，進一步免疫新西蘭大白兔制備了抗 UspA1蛋白 PcAb，為進一步建立卡他莫拉菌快速檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒及實驗動物

卡他莫拉菌ATCC 25238 購自ATCC。克隆宿主菌E. coli Top 10、表達宿主菌E. coli Rosetta(DE3)、表達載體 pET-28a(+)均為本實驗室保存。新西蘭大白兔由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要試劑

核酸分子量標準、蛋白質(zhì)分子量標準、彩色預(yù)染蛋白分子量標準、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NdeⅠ、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒DNA小量試劑盒、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。96孔板、羊抗兔IgG-HRP、TMB、硝酸纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 購自武漢博士德生物工程有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。羧基水溶性量子點 (12?18 nm) 購自武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限責任公司。組氨酸親和預(yù)裝柱、Protein A親和預(yù)裝柱為GE healthcare公司產(chǎn)品。

1.3 uspa1基因克隆與重組表達載體 pET-28auspa1的構(gòu)建

對天然Mc表面蛋白 UspA1 (GenBank accession number為AAF36416) 進行生物信息學分析，獲取其胞外保守結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段 (522?710 aa)，找到其對應(yīng)的DNA編碼序列，引入大腸桿菌偏好性密碼子，優(yōu)化后在其5′引入酶切位點NdeⅠ、3′端引入終止信號 TAA和酶切位點XhoⅠ后化學合成全基因序列 (圖1)，記為uspa1(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后連于載體 pUC57-Sample上)。將質(zhì)粒pUC57-Sample-uspa1和載體pET-28a(+)雙酶切回收后進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli Top 10感受態(tài)細胞中，用卡那霉素抗性平板和酶切鑒定篩選陽性單克隆進行測序。選擇測序未突變且讀碼框正確的重組原核表達載體pET-28a-uspa1。

1.4 融合蛋白UspA1-His的表達、可溶性分析及純化

將重組載體 pET-28a-uspa1和空載體pET-28a(+)分別轉(zhuǎn)入到E. coli Rosetta(DE3) 表達菌中，挑取單菌落加入到100 mL含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取1 mL接入1 L含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達4 h，離心收集菌體。菌體經(jīng)超聲裂解后，12 000 r/min離心15 min，收集上清。上清進行親和層析純化，得到重組蛋白。

圖1 uspa1核苷酸基因全序列Fig. 1 The whole genome sequence of uspa1. The underlined sequences are recognition sites of restriction endonuclease.

1.5 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的制備及純化

將上述純化的重組UspA1-His融合蛋白稀釋后，按照200 μg (1 mL) 與1 mL弗氏完全佐劑混勻乳化后免疫2只雄性新西蘭大白兔，于背部皮下多點注射。間隔7 d后再免疫1次，再過14 d后用上述純化的重組 UspA1-His融合蛋白按照200 μg (1 mL) 與1 mL弗氏不完全佐劑混勻乳化后進行加強免疫，加強免疫7 d后，再按上述同樣方法再加強免疫一次。7 d后取血以UspA1-His包被酶標板，間接ELISA法測定效價。若效價大于 1×105，則心臟采血，分離血清，否則需再進行加強免疫。以A蛋白親和層析預(yù)裝柱純化PcAb IgG，用A280測定抗體濃度，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)整為1 mg/mL，–20 ℃保藏備用。

1.6 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的效價測定

用間接ELISA方法測定抗UspA1-His融合蛋白PcAb效價。以4 μg/mL的UspA1-His包被酶標板 (100 μL/孔)，37 ℃恒溫孵育 1 h，經(jīng)洗滌、封閉后，加入100 μL倍比稀釋的抗UspA1-His融合蛋白PcA，初始濃度為10 μg/mL。以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG (HRP-IgG) 為二抗進行測定。陰性參照以免疫前血清代替一抗。根據(jù)450 nm處吸光值 (OD450) 判斷結(jié)果。判定方法，S/N=(待檢OD450) / (陰性對照OD450)。S/N>2.1為陽性。以S/N>2.1所對應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價。

1.7 抗UspA1-His融合蛋白PcAb鑒定

1.7.1 Western blotting方法鑒定

利用Western blotting鑒定抗UspA1-His融合蛋白PcAb對天然Mc的識別能力。將Mc超聲破胞上清及 UspA1-His融合蛋白處理后進行 SDSPAGE分析。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、干燥、封閉后，加入待檢多抗，以HRP-IgG為二抗進行反應(yīng)。清洗后，以超敏ECL化學發(fā)光即用型底物混合物完全覆蓋印跡膜2–3 min，超靈敏多功能成像儀下獲取膠片。

1.7.2 免疫熒光方法鑒定

利用直接免疫熒光法，鑒定UspA1-His融合蛋白PcAb對Mc抗原的識別能力。首先用可溶性羧基量子點標記抗UspA1-His融合蛋白PcAb (按說明書操作)，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下觀察標記效果。再以該標記抗體作為特異性熒光抗體，將其滴加于固定有Mc菌液的載玻片上，用水洗去多余未參加反應(yīng)的熒光抗體。干燥后用超分辨熒光顯微鏡觀察Mc菌體與量子點標記抗體的結(jié)合情況。

1.7.3 間接ELISA方法鑒定

利用間接ELISA法，測定UspA1-His融合蛋白 PcAb對Mc抗原的識別能力。以Mc菌液(OD460=0.504) 包被酶標板，封閉后加入100 ng/mL的待檢抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG (HRP-IgG) 為二抗進行測定。陰性參照以待檢抗體緩沖液為一抗，陽性參照包被 UspA1-His融合蛋白。根據(jù)450 nm處吸光值 (OD450) 判斷結(jié)果。判定方法：S/N= (待檢OD450) / (陰性對照OD450)。S/N>2.1為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 uspa1基因克隆與重組表達載體pET-28a-uspa1的構(gòu)建

如圖 2A中顯示，通過雙酶切方法，從質(zhì)粒pUC57-Sample-uspa1中獲得大小為570 bp的目的片段，重組質(zhì)粒pET-28a-uspa1經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，出現(xiàn)大小與目的片段一致的條帶(圖2B)?；驕y序結(jié)果正確。

2.2 融合蛋白UspA1-His表達與純化

對含質(zhì)粒 pET-28a-uspa1的重組菌進行誘導(dǎo)表達，在24 kDa處誘導(dǎo)表達出目的蛋白 (圖3A)。超聲裂解后在上清和沉淀中均含有目的蛋白。取誘導(dǎo)表達上清用鎳柱進行純化，得到純化的UspA1-His。以A280測定蛋白濃度為 0.4 mg/mL(圖 3B)。

2.3 抗UspA1-His融合蛋白PcAb的制備及純化

兔子經(jīng) 4次免疫后，以間接 ELISA測定血清中抗體的效價可達到 1∶512 000以上，經(jīng) A蛋白親和層析純化后最終可獲得450 mg的特異性抗體。

圖2 uspa1基因克隆與重組表達載體pET-28a-uspa1的構(gòu)建Fig. 2 Cloning of uspa1 gene and construction of its recombinant expression vector pET-28a-uspa1. (A) Digestion of pET-28a and pUC57-Sample-uspa1 plasmid with restriction enzyme NdeⅠ and XhoⅠ. (B) Digestion of pET-28a-uspa1 plasmid with restriction enzyme NdeⅠand XhoⅠ.

2.4 間接ELISA測定抗UspA1-His融合蛋白PcAb的效價

抗UspA1-His融合蛋白 PcAb的效價測定結(jié)果 (圖4) 顯示，當用倍比稀釋法將待檢抗體稀釋512 000倍時，S/N=2.69>2.1，為陽性結(jié)果。若繼續(xù)稀釋，S/N將小于2.1，因此所得抗體的效價為1∶512 000。

圖3 UspA1-His蛋白的表達與純化Fig. 3 Expression and purification of recombinant protein UspA1. (A) Expression of recombinant protein UspA1. M: protein marker; lane 1: UspA1-His before expression; lane 2: UspA1-His after expression; lane 3:supernatant after ultrasonication; lane 4: precipitation after ultrasonication. (B) Purification of recombinant protein UspA1-His. M: protein marker; lane 1: flow-through solution; lane 2: elution buffer with 10 mmol/L glyoxaline;lane 3: elution buffer with 20 mmol/L glyoxaline; lane 4:elution buffer with 40 mmol/L glyoxaline; 5: elution buffer with 100 mmol/L glyoxaline; lane 6: elution buffer with 150 mmol/L glyoxaline.

2.5 抗UspA1-His融合蛋白PcAb鑒定

2.5.1 Western blotting方法鑒定

Western blotting鑒定抗體結(jié)果見圖5，泳道1中出現(xiàn)條帶，表明抗 UspA1-His PcAb能夠識別UspA1-His融合蛋白。泳道2中72–95 kDa之間出現(xiàn)的條帶與UspA1 (88 kDa) 分子量大小相符，表明抗UspA1-His融合蛋白PcAb能夠識別Mc表面蛋白UspA1。

圖 4 間接 ELISA方法檢測抗 UspA1-His融合蛋白PcAb效價Fig. 4 The titer assay of the PcAb against recombinant protein UspA1-His.

圖 5 Western blotting鑒定抗 UspA1-His融合蛋白PcAbFig. 5 Identification of the PcAb against recombinant protein UspA1-His by Western blotting. M: protein marker; lane 1: recombinant protein UspA1-His; lane 2:supernatant of Mc after ultrasonication.

2.5.2 免疫熒光方法鑒定

用可溶性羧基量子點標記抗UspA1-His融合蛋白 PcAb，1%瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下鑒定結(jié)果見圖 6A。結(jié)果顯示，標記了抗體的量子點比未標記抗體的量子點分子量大，說明抗體標記成功。量子點標記抗體與Mc菌體反應(yīng)后，超分辨熒光顯微鏡下觀察結(jié)果見圖6B。結(jié)果顯示，視野中可觀察到紅色亮點，說明量子點標記PcAb能夠識別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。

圖6 免疫熒光法鑒定Fig. 6 Identification by direct immunofluorescence. (A)Detection of the labelled PcAb. Lane 1: the unlabelled PcAb; lane 2: the labelled PcAb. (B) The labelled PcAb’s recognition to Mc.

2.5.3 間接ELISA方法鑒定

間接 ELISA 法鑒定抗體結(jié)果顯示，S/N=46.701>2.1，結(jié)果為陽性，說明待檢抗UspA1-His融合蛋白PcAb能有效識別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。該結(jié)果與2.5.2中免疫熒光鑒定結(jié)果一致。

3 討論

本研究對卡他莫拉菌UspA1蛋白進行生物信息學分析，獲取了其胞外保守結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段 (522?710 aa)，避免了多余肽段的無效表達，提高了重組抗原的有效性。密碼子優(yōu)化協(xié)調(diào)是進行蛋白質(zhì)異源系統(tǒng)表達常用的手段。本文對uspa1基因進行原核密碼子優(yōu)化后，獲得了可溶性表達的目的蛋白。重組表達的小分子蛋白免疫原性強，免疫后所得多克隆抗體量大、親和力高。本文用800 μg表達的重組蛋白UspA1-His免疫新西蘭兔，經(jīng)4次免疫后得到總量450 mg的多克隆抗體，效價可達1∶512 000。

Ackermann等[26]研究發(fā)現(xiàn)UspA1作為Oca家族成員，其保守功能域(742?832 aa)與 YadA、EibA、Hia等多個蛋白的相關(guān)結(jié)構(gòu)域在三維結(jié)構(gòu)上高度相似，但氨基酸序列一致性很低 (最高為10.99%)，因此本文依據(jù)該保守結(jié)構(gòu)域及其附近區(qū)域 (522?710 aa) 制備的多克隆抗體可保證其特異性。

本研究所制備的抗卡他莫拉菌表面蛋白UspA1胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體不僅能識別UspA1-His重組蛋白，而且可識別Mc表面蛋白UspA1的胞外暴露區(qū)。該研究為進一步建立基于抗原的卡他莫拉菌快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

目前，正在利用該表面暴露區(qū)制備相應(yīng)的單克隆抗體。單克隆抗體制備完成后將與該多克隆抗體進行配對，制備基于量子點免疫層析的檢測試劑盒。

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