朱磊 王金杰 張佳穎 莊汝杰

膝骨性關節(jié)炎（KOA）是骨科臨床常見病、多發(fā)病，是中老年人致殘的主要因素之一[1]。相關研究表明血管內皮生長因子（VEGF）在KOA軟骨退變過程中具有重要作用[2]，且能刺激軟骨細胞產生多種基質降解酶[3]，其中基質金屬蛋白酶13（MMP－13）是最重要也是最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶。本研究建立KOA大鼠模型并用新生血管生成抑制劑舒尼替尼進行治療，觀察治療后不同時點VEGF、MMP－13表達水平的變化，為防治KOA提供新思路?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 4～5月齡健康SD雄性大鼠32只，體重（190±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.2 主要試劑及器材 木瓜蛋白酶（批號：MB3052，美國 MERK 公司）、舒尼替尼（50mg，批號：H20130261，美國 sigma公司）、VEGF ELISA試劑盒（96T，批號：EIA06604r，武漢新啟迪生物科技有限公司）、MMP－13 ELISA 試劑盒（96T，批號：EIA06074r，武漢新啟迪生物科技有限公司）、電子恒溫箱（型號：HPX－9052 MBE，上海博迅實業(yè)有限公司）、臺式離心機（型號：SORVALL，德國Heraeu公司）、酶標分析儀（型號：DNM－9602，北京普朗新技術有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將32只大鼠隨機分為4組，即空白組、治療4周組、治療8周組及對照組各8只。4組大鼠在相同條件下籠養(yǎng)，自由攝食，飲水，室溫控制在18～22℃。

1.3.2 造模方法 在常規(guī)無菌下操作。提前從冰箱取出木瓜蛋白酶，靜置30min；配置含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液，充分振蕩、混勻?？瞻捉M大鼠不作任何處理，其余3組大鼠分別于第1、3、5天關節(jié)腔注射含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液，進行KOA造模。具體操作如下：使用呼吸麻醉機使大鼠麻醉，仰臥位固定于木板上，剃去左、右膝關節(jié)腔周邊1cm區(qū)域的腿毛，絡合碘消毒，體積分數(shù)75%的乙醇脫碘；屈曲45°以髕骨下級髕腱外緣為進針點，向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2mm，注入0.2ml含4%木瓜蛋白酶的0.9%氯化鈉溶液；2周后，KOA模型建立[4]。

1.3.3 給藥方法 KOA造模成功后，空白組不給任何藥物；治療 4 周組大鼠灌胃舒尼替尼 1mg·kg－1·d－1，持續(xù)4 周；治療 8 周組大鼠灌胃舒尼替尼 1mg·kg－1·d－1，持續(xù)8周；對照組每天灌胃同等體積的0.9%氯化鈉溶液。4組大鼠自由攝食，飲水，室溫控制在18～22℃。

1.3.4 指標檢測 實驗結束后，麻醉大鼠作脫頸處死，切開雙膝關節(jié)腔，1ml 0.9%氯化鈉溶液沖洗關節(jié)腔，使0.9%氯化鈉溶液與關節(jié)液充分混合，用注射器抽取收集關節(jié)液標本。4 000r/min離心5min，取上清液，置于－20℃冰箱下密封保存；采用ELISA法檢測關節(jié)液中 VEGF、MMP－13 表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠關節(jié)液中VEGF表達水平比較 與對照組比較，治療4周組、治療8周組大鼠關節(jié)液中VEGF表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；治療4周組與治療8周組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 4組大鼠關節(jié)液中VEGF表達水平比較

2.2 4組大鼠關節(jié)液中MMP－13表達水平比較 與對照組比較，治療4周組、治療8周組大鼠關節(jié)液中MMP－13表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；治療4周組與治療8周組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 4組大鼠關節(jié)液中MMP-13表達水平的比較

3 討論

KOA是一種多發(fā)于中老年的慢性退行性疾病，以關節(jié)軟骨退行性變、骨贅形成、滑膜炎癥為主要特征，臨床表現(xiàn)為慢性關節(jié)疼痛、僵硬、肥大及活動受限。其病因目前尚不明確，普遍認為與年齡、性別、肥胖、磨損、內分泌、生化、種族、遺傳、細胞因子、免疫等因素有關。KOA的發(fā)病機制及治療一直是骨科學研究者和骨科臨床醫(yī)生所面臨的重要問題。

成人膝關節(jié)關節(jié)軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞是關節(jié)軟骨的唯一細胞成分，具有產生和維持細胞外軟骨基質的作用[5]。軟骨細胞生存在一個相對缺氧的環(huán)境中，主要是以無氧代謝來產生高能磷酸鍵。相關研究表明，一些血管生成因子（如VEGF）參與了軟骨的代謝，并在KOA的進展中發(fā)揮重要作用[6]。Horner等[7]研究結果表明，正常軟骨細胞幾乎不分泌VEGF；而KOA患者關節(jié)液中有大量VEGF，從而促進新生血管生成，導致軟骨下骨的破骨性吸收，使得軟骨結構被破壞。Tsai等[8]、賈奇學等[9]研究表明，KOA患者關節(jié)液中有大量的促炎性細胞因子，VEGF通過上調軟骨細胞MMP－13表達，從而促進KOA的病情發(fā)展。MMP－13是最重要、最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶，也是KOA發(fā)病過程中其他金屬蛋白酶亞型對Ⅱ型膠原產生降解作用的最主要靶點。有文獻報道在KOA病變部位的軟骨中，MMP-13 mRNA表達程度與其組織損壞程度基本一致[10]。VEGF能刺激軟骨細胞產生大量金屬蛋白酶，使MMP-13的表達增加，從而破壞原來與金屬蛋白酶抑制劑之間的平衡狀態(tài)，加速Ⅱ型膠原的降解，最終導致軟骨結構的進一步破壞。

VEGF作為重要的血管調控因子，能與其受體VEGFR特異性結合，促進新生血管的增生。舒尼替尼作為一種多靶點的小分子胞內酪氨酸激酶抑制劑，主要通過選擇性抑制 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及血小板源性生長因子受體（PDGFR），來達到阻斷VEDF/VEGFR信號通路，抑制新生血管增生[11]，從而起到治療KOA的作用。本實驗結果表明，實驗前4周大鼠關節(jié)液中VEGFR表達水平升高，而舒尼替尼能有效抑制VEGFR的表達，減輕對關節(jié)軟骨的破壞；同時使MMP-13表達下調，減慢Ⅱ型膠原的降解，保護軟骨結構免被進一步破壞。實驗后4周，關節(jié)液中VEGFR表達水平較低，舒尼替尼的抑制效果與VEGFR表達水平趨于平衡，將VEGF、MMP-13的表達維持在較低水平。

綜上所述，新生血管生成抑制劑舒尼替尼能有效降低關節(jié)液中VEGF、MMP-13表達水平，長期用藥可將VEGF和MMP-13的表達維持在較低水平，從而達到防治KOA的作用。本實驗為KOA的防治提供了新思路，也為新類藥物的研發(fā)提供了實驗基礎。

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