陳泠 高春保 王翠 朱展望 佟漢文 劉易科 張宇慶 鄒娟 何偉杰

摘要：為了篩選出有效的穗發(fā)芽抗性相關(guān)分子標記，利用240份小麥品種（系）4年的整穗發(fā)芽率數(shù)據(jù)對Tamyb10D和Vp1B3標記的有效性進行了驗證。結(jié)果表明，①紅粒比白?？顾氚l(fā)芽;②在不區(qū)分紅白粒的情況下，兩標記可用，Tamyb10D標記相對更好;③在區(qū)分紅白粒的情況下，Tamyb10D標記僅在紅粒中可用，而Vp1B3標記不可用;④Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型在紅粒中的出現(xiàn)頻率高于白粒，特別是前者差異大（紅粒、白粒分別為64.79%和1.78%）。由此推斷，在不考慮子粒顏色時，兩標記與穗發(fā)芽抗性的相關(guān)性主要是由其與紅色子粒的相關(guān)性決定的，而非其自身作用。綜上所述，Tamyb10D標記可用于紅?？顾氚l(fā)芽種質(zhì)篩選，Vp1B3標記不可用于紅粒和白?？顾氚l(fā)芽種質(zhì)篩選。

關(guān)鍵詞：小麥;穗發(fā)芽;分子標記;Tamyb10D;Vp1B3

中圖分類號：S512.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0066-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.018? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： To acquire valuable marker for pre-harvest sprouting resistance（PHS），the value of two markers（Tamyb10D and Vp1B3） were estimated in 240 wheat varieties during four years. The results were as follows：①Red-grained wheat were more tolerant to PHS than white-grained wheat.②Two makers were effective to select PHS resistant varieties without considering grain color. And Tamyb10D was more better than Vp1B3. ③Tamyb10D was associated with PHS resistance in red-grained wheat but not in white-grained wheat. While Vp1B3 was not associated with PHS resistance either in red-grained wheat or white-grained wheat.④The frequencies of Tamyb10-D1b and Vp-1Bc were higher in red-grained wheat than those in white-grained wheat. Especially for the allele Tamyb10-D1b，its frequency was 64.79% in red-grained wheat while only 1.78% in white-grained wheat. Above results indicated that the correlations between these two markers and PHS resistance were mostly determined by their correlation with red grained wheat，not by their own functions. In conclusion， marker Tamyb10D can be used to select PHS resistant varieties in red-grained wheat. But marker Vp1B3 can not be used to select PHS resistant varieties both in red-grained and white-grained wheat.

Key words： wheat; pre-harvest sprouting; molecular marker; Tamyb10D; Vp1B3

小麥穗發(fā)芽是指小麥即將成熟未收獲時遇連陰雨天氣，導(dǎo)致子粒在穗上萌動發(fā)芽的現(xiàn)象。子粒發(fā)芽過程中會代謝掉營養(yǎng)物質(zhì)淀粉，引起產(chǎn)量下降，子粒品質(zhì)劣化，萌動或發(fā)芽的子粒種用價值降低。小麥穗發(fā)芽分布范圍廣、危害嚴重。中國長江中下游冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)和西南冬麥區(qū)以及加拿大、澳大利亞等國內(nèi)外小麥主產(chǎn)區(qū)都時有發(fā)生，對小麥產(chǎn)量的提升和品質(zhì)的保障帶來了威脅。如2018年夏收期間湖北地區(qū)遭遇連陰雨，特別是鄂北等主產(chǎn)區(qū)小麥減產(chǎn)達50%左右。發(fā)芽嚴重小麥只能作為飼料出售，價格降低一半以上，致使種麥效益嚴重下滑，極大地挫傷了農(nóng)民的種麥積極性。

抗穗發(fā)芽品種的應(yīng)用是解決穗發(fā)芽危害的最經(jīng)濟有效的方法，利用功能標記可加快品種培育進程。目前，已鑒定與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因有TaVp-1[1，2]、Tamyb10[3]、TaSdr[4]、TaPHS1[5，6]、PM19[7]、TaDFR[8]和MKK3[9]等。其中對標記有效性評價研究較多的是TaVp-1和Tamyb10的分子標記。轉(zhuǎn)錄因子Tamyb10推測可能是控制小麥種皮顏色R基因的候選基因[3]。Wang等[10]利用Tamyb10的分子標記對103個小麥品種（系）的基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)標記Tamyb10B和Tamyb10D與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，前者效應(yīng)大于后者，Tamyb10A標記與穗發(fā)芽抗性相關(guān)性不顯著。Vp-1基因是種子成熟、干燥及休眠的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能促進胚成熟，加速休眠并抑制其萌發(fā)[1]。Yang等[2]利用Vp-1基因3B染色體上的不同基因型開發(fā)了Vp1B3標記，檢測到3種基因型：Vp-1Ba、Vp-1Bb和Vp-1Bc，前者與感穗發(fā)芽有關(guān)，后兩者與抗穗發(fā)芽相關(guān)。

為了篩選穩(wěn)定可靠的分子標記用于穗發(fā)芽抗性育種，本研究利用240份小麥群體的4年穗發(fā)芽表型數(shù)據(jù)對已報道的穗發(fā)芽抗性分子標記Tamyb10D和Vp1B3進行了有效性鑒定，以期為穗發(fā)芽抗性分子育種工作提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

240份小麥群體含國內(nèi)近20年育成的小麥品種（系）229份，分別來自河南（62份）、江蘇（38份）、山東（27份）、陜西（21份）、湖北（20份）、四川（18份）、河北（13份）、甘肅（9份）、北京（7份）、山西（6份）、寧夏（5份）和安徽（3份）。另含有國外材料11份，其中CIMMYT材料8份。2014-2018年共計4年度種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所稻茬田（武漢洪山）。

1.2? 整穗發(fā)芽率測定

小麥材料生理成熟后，采集無病害小麥穗10穗（含穗下節(jié)10 cm），室內(nèi)自然干燥7 d后，保存在-20 ℃冰柜中備用。整穗發(fā)芽在溫室內(nèi)采用自動模擬降雨設(shè)備進行，每4 h噴霧20 min，溫度設(shè)定為20 ℃，連續(xù)處理5 d后發(fā)芽穗保存在-20 ℃冰柜。人工脫粒統(tǒng)計發(fā)芽粒數(shù)和未發(fā)芽粒數(shù)，以芽長度超過1/2種子長度記為發(fā)芽。

發(fā)芽率（SGR）=10穗發(fā)芽粒數(shù)×100%/（10穗發(fā)芽粒數(shù)+10穗未發(fā)芽粒數(shù)）。

1.3? 抗穗發(fā)芽分子標記檢測

采用CTAB法[11]提取葉片基因組總DNA。分子標記引物Tamyb10D[10]和Vp1B3[2]由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成（表1），PCR試劑為康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)的2×Es Taq MasterMix（Dye），擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后觀察拍照。

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用IBM SPSS Statistics 20對數(shù)據(jù)進行Pearson相關(guān)系數(shù)和單因素方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 子粒顏色與穗發(fā)芽抗性關(guān)系

240份小麥材料的SGR分布較廣，特別是2018年為1.21%～99.70%，而2016年SGR較高，為30.40%～99.19%（表2）。不同年份間SGR呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.355～0.650（表3），說明測定的SGR可用于進一步分析。

240份小麥群體中有71份紅粒小麥，169份白粒小麥。不同年份紅粒小麥SGR均值都小于白粒小麥，且兩者差異均達到極顯著水平（表4），說明紅粒小麥比白粒小麥抗穗發(fā)芽。

2.2? Tamyb10D標記的有效性分析

用Tamyb10D標記分析240份材料，共檢測到191份材料為Tamyb10-D1a基因型，49份材料為抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b[10]，出現(xiàn)頻率分別為79.58%和20.42%（表5）。兩種基因型的各年份SGR均值比較顯示，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值均低于Tamyb10-D1a基因型，除2016年外，兩者SGR均值差異都達到極顯著水平（P<0.001）。

對紅粒材料中Tamyb10-D1a和Tamyb10-D1b基因型進行分析，結(jié)果（表5）表明，71份紅粒材料中，抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b占比為64.79%，說明紅粒小麥中該基因型出現(xiàn)頻率較高。SGR均值分析發(fā)現(xiàn)，除2016年外，Tamyb10-D1b基因型的SGR均值都低于Tamyb10-D1a基因型，但差異分析顯示，僅2018年兩者差異達到極顯著水平（P=0.005）。

169份白粒材料分析（表5）發(fā)現(xiàn)，僅有3份材料含有Tamyb10-D1b基因型，出現(xiàn)頻率為1.78%。SGR均值比較顯示，2018年Tamyb10-D1b基因型的SGR均值高于Tamyb10-D1a基因型，其他年份則相反，但差異都未達顯著水平。綜上所述，在紅粒小麥中Tamyb10-D1b基因型對穗發(fā)芽抗性有顯著作用，但在白粒小麥中對穗發(fā)芽抗性沒有明顯作用。

2.3? Vp1B3標記的有效性分析

240份材料中，利用Vp1B3標記共檢測到4種基因型，其中基因型Vp-1Ba和抗穗發(fā)芽基因型Vp-1Bc[2]出現(xiàn)頻率較高，分別為27.92%和70.83%（表6）。此外，檢測到Vp-1Bd基因型2份和Vp-1Bb基因型1份。SGR均值比較顯示，除2016年外，Vp-1Ba基因型的SGR均值均高于Vp-1Bc基因型，但僅2018年兩者差異達到極顯著水平（P<0.01）。

對紅粒材料中Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)Vp-1Bc基因型在紅粒中出現(xiàn)頻率高達87.32%，而含Vp-1Ba基因型的材料只有8份。SGR均值比較顯示，除2015年外，各年份Vp-1Ba基因型的SGR均值均低于Vp-1Bc基因型，但差異均未達到顯著水平（表6）。

在白粒材料中，Vp-1Ba和Vp-1Bc基因型分別占34.91%和63.91%，Vp-1Ba基因型的出現(xiàn)頻率在白粒中比紅粒中高。兩基因型各年份SGR均值比較顯示，2018和2015年，Vp-1Bc基因型的SGR均值低于Vp-1Ba基因型，而2017和2016年結(jié)果相反，但各年份兩者差異都較小，均未達顯著水平（表6）。表明Vp1B3標記不能用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選。

3? 小結(jié)與討論

通過比較240份紅白粒材料在4個年份的SGR，發(fā)現(xiàn)紅粒材料的SGR均值都極顯著小于白粒材料，即紅粒材料比白粒材料抗穗發(fā)芽，與前人研究結(jié)果一致[12]。但紅粒材料中同樣有SGR較高的材料，如川麥43和寧春47號，4個年份的SGR變異范圍分別為62.02%～91.25%和72.53%～84.25%。因此，紅粒小麥也需要進行穗發(fā)芽抗性性狀鑒定以便準確選出抗性品種。

前人研究證實Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型與抗穗發(fā)芽相關(guān)，Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型與感穗發(fā)芽相關(guān)[2，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在不區(qū)分紅白粒的情況下，SGR均值說明Tamyb10-D1b和Vp-1Bc基因型較Tamyb10-D1a和Vp-1Ba基因型抗穗發(fā)芽。但在區(qū)分紅白粒的情況下，僅紅粒中2018年數(shù)據(jù)顯示Tamyb10-D1b基因型較Tamyb10-D1a基因型抗穗發(fā)芽，兩者差異顯著。分析基因型出現(xiàn)頻率發(fā)現(xiàn)，抗穗發(fā)芽基因型Tamyb10-D1b和Vp-1Bc在紅粒中的出現(xiàn)頻率高于白粒，紅粒中兩者出現(xiàn)頻率分別是64.79%和87.32%，在白粒中則為1.78%和63.91%。由此推測，在不區(qū)分紅白粒的情況下，抗穗發(fā)芽基因型與感穗發(fā)芽基因型間的SGR均值差異是由于紅白粒穗發(fā)芽抗性差異造成的，而非基因型本身的作用。

本研究證實，Tamyb10D標記可用于紅粒小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，Vp1B3標記不能用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選，該結(jié)果與部分前人研究結(jié)果一致[13-15]。如王根平等[13]證實Tamyb10D標記在紅粒小麥中有效。楊燕等[14]分析了67份紅粒春小麥的發(fā)芽指數(shù)與Vp1B3標記相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者無相關(guān)性。孫果忠等[15]對中國75個品種進行分析，也證實Vp1B3標記與穗發(fā)芽抗性關(guān)系不密切。本研究結(jié)論也與一些已報道結(jié)果不一致[16，17]，可能是由于研究群體和研究環(huán)境不同以及未區(qū)分紅白粒情況下分析數(shù)據(jù)造成的。

綜上所述，本研究通過240份材料4年的穗發(fā)芽性狀數(shù)據(jù)，對Tamyb10D標記和Vp1B3標記進行有效性鑒定，證實前者可用于紅粒小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，后者不可用于紅粒和白粒穗發(fā)芽抗性品種篩選。

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