林 琳，閆 蕊，劉 昕，李 青，刁佳宇，張 明，單 虎，魏 瑾

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院：1. 心內(nèi)科；2. 呼吸科，陜西西安 710004)

心肌炎(myocarditis, MC)是一種以心肌間質(zhì)廣泛炎癥細胞浸潤為主要特點, 導致青壯年心衰、猝死的常見心血管疾病，過度自身免疫反應是重要的病理機制，部分患者最終可進展為擴張型心肌病[1](dilated cardiomyopathy, DCM)。研究表明，大量巨噬細胞浸潤及活化促進心肌炎的發(fā)生與發(fā)展。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)最初被認為是一種來源于遲發(fā)型超敏反應過程中活化的T細胞，進化上相對保守的促炎因子，并證明其具有調(diào)節(jié)炎癥因子分泌、影響巨噬細胞分化、遷移的作用[2]。MIF已被證明參與腦脊髓炎[3]，類風濕關節(jié)炎[4]、潰瘍性結(jié)腸炎等多種急慢性炎癥性疾病的病理過程[5]。然而，MIF在自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis, EAM)中的表達及作用鮮有報道。

白藜蘆醇( resveratrol)是具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎等多種功效的植物抗毒素，目前僅有少量研究報道其對自身免疫性心肌炎具有一定的治療作用[6]。本研究檢測了白藜蘆醇對實驗性自身免疫性心肌炎大鼠心肌組織中MIF蛋白的表達變化，并觀察了其對心肌病理損傷、巨噬細胞浸潤及心臟功能的影響。從而，進一步探討白藜蘆醇是否通過調(diào)節(jié)MIF表達及相關功能發(fā)揮心肌保護作用，以期為治療心肌炎提供新的理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 雄性Lewis大鼠24只，6周齡，體質(zhì)量180～210 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；室溫飼養(yǎng)于SPF級動物房，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。MIF多克隆抗體購自于武漢三鷹生物科技公司；CD68單克隆抗體購自于美國Abcam生物科技公司；β-actin多克隆抗體購自美國CST公司；HRP標記的抗兔二抗購自西安壯志生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及建模 24只實驗大鼠采用隨機數(shù)字法分為對照組(Con組，n=8)、模型組(MC組，n=8)、白藜蘆醇干預組(MC+Res組，n=8)。將豬心肌球蛋白和等量弗氏完全佐劑混合，采用注射器對推法制備均一乳濁液。MC組及MC+Res組分別在第0、7天，以0.2 mL豬心肌肌球蛋白免疫乳液于大鼠后肢足墊處注射進行免疫造模；MC+Res組于第0天，免疫后即開始給予白藜蘆醇[溶解于羧甲基纖維素鈉，sodium carboxymethylcellulose, CMC-Na，50 mg/(kg·d)]灌胃治療，連續(xù)21 d。同時，在Con組大鼠后肢足墊處進行等量完全弗氏佐劑注射，并每日給與等體積CMC-Na灌胃；實驗所用大鼠經(jīng)倫理委員會批準使用，操作過程盡量減少實驗動物的痛苦，所有實驗過程均遵循西安交通大學實驗動物管理與使用條例。

1.3 超聲心動圖檢測 按100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后應用超聲心動圖檢測儀器(Philips iE33)記錄心率(heart rate, HR)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular short axis reduced rate, LVFS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular-systolic diameter, LVEDs)。

1.4 蘇木素-伊紅染色 快速切取大鼠心臟，稱取心臟質(zhì)量。用于病理組織切片的標本浸泡于100 mL/L中性甲醛溶液，24 h后常規(guī)包埋，切片厚約4 μm，常規(guī)脫蠟至水，進行蘇木素-伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色。依據(jù)顯微鏡下觀測并進行評分：0分：沒有炎癥；1分：每個視野下1～5個炎癥細胞浸潤灶且炎癥浸潤范圍小于整個視野的5%；2分：每個視野多于5個炎癥細胞浸潤灶或者炎癥范圍大于5%但小于20%；3分：彌漫性炎癥細胞浸潤，范圍超過20%，但沒有壞死；4分：彌漫性炎癥細胞浸潤伴隨心肌細胞壞死。每只心臟至少取3個橫切面，每組內(nèi)選取8只大鼠心肌切片染色進行統(tǒng)計分析。

1.5 Western blot法檢測大鼠心肌組織MIF蛋白的表達 將50 mg組織研磨并裂解于1 000 μL RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)中，按說明書步驟提取心肌勻漿蛋白，保存于-80 ℃冰箱。提取的蛋白用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。同質(zhì)量上樣后以60 g/L SDS-PAGE膠進行分離，轉(zhuǎn)膜至0.22 μm PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉與PBST配制的封閉液封閉1 h，以MIF抗體稀釋液(1∶800，ProteinTech Group, USA)，或GAPDH(1∶1 000，CST，USA)在4 ℃冰箱孵育過夜，HRP標記的抗兔二抗(1∶2 000，西安壯志生物科技有限公司，西安)室溫孵育1.5 h，ECL化學發(fā)光后進行曝光、顯影。采用Quantity One軟件進行分析。

1.6 免疫組化法檢測巨噬細胞表面標記分子CD68的表達 按常規(guī)ABC法進行免疫組化檢測。實驗中采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對照，在切片上滴加CD68(1∶1 000，abcam, USA)一抗稀釋液，二抗結(jié)合并室溫孵育1 h，洗滌后滴加DAB顯色液，脫水透明，中性樹膠封片，細胞質(zhì)棕黃色為陽性染色細胞。進行CD68陽性細胞計數(shù)：Olympus攝影顯微鏡技術心肌組織CD68陽性細胞，取其均值進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 第21天，MC組大鼠死亡1只，其余各組大鼠均無死亡。Con組大鼠毛發(fā)光亮，精神狀態(tài)及活動無明顯異常；MC組大鼠安靜狀態(tài)即出現(xiàn)氣短、易激惹，活動減少，伴有精神不振及毛色粗糙暗淡；MC+Res組大鼠一般狀況較MC組明顯改善。

2.2 各組大鼠心臟超聲心動圖檢查及心臟肉眼觀察結(jié)果 與Con組相比較，各組大鼠LVEDd之間無顯著差異；MC組大鼠心臟體質(zhì)量比(P=0.003 4)、心率(P=0.004 1)、LVEDs (P=0.003 2)均較Con組顯著增加，而LVEF(P=0.005 8)、LVFS(P=0.007 3)明顯降低。與MC組比較，MC+Res組大鼠心臟LVEDs(P=0.028)、心率(P=0.031)顯著降低，而LVEF(P=0.040)、LVFS(P=0.046)均較MC組顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化

Fig.1 The cardiac structure and functional changes of rats by echocardiography

A：左室收縮末內(nèi)徑(LVEDs)；B：左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)；C：心率(heart rate)；D：左室短軸縮短率(LVFS)；E：左室射血分數(shù)(LVEF)；F：心臟體質(zhì)量比(HW/BW)。與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

超聲心動圖檢查結(jié)束后迅速打開胸腔，肉眼可見Con大鼠心臟均無明顯胸腔積液，心臟表面及形態(tài)未見明顯異常；MC組6/7只出現(xiàn)大量胸腔積液，肉眼可見心臟體積增大，表面灰白、僵硬，局部心肌組織明顯水腫，顏色變暗；MC+Res組2/8只出現(xiàn)少量胸腔積液，心臟肉眼病變較MC組大鼠明顯減輕。

2.3 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 與Con組比較，MC組大鼠心肌細胞排列紊亂，肌絲斷裂，邊界不清，部分心肌細胞溶解，心肌組織可見大面積炎癥細胞浸潤。病理評分提示，MC+Res組大鼠心肌組織中炎癥細胞浸潤程度相較于MC組顯著減少(P=0.037)，心肌損傷明顯減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織病理損傷及炎癥細胞浸潤程度的變化

Fig.2 Histopathological changes and degree of inflammatory cell infiltration in the myocardium of rats (×100)

A：對照組；B：模型組；C：白藜蘆醇干預組；D：心肌組織病理評分統(tǒng)計分析；與模型組比較：#P<0.05。

2.4 各組大鼠心肌組織中CD68免疫組化結(jié)果 棕色顆粒主要存在于細胞質(zhì)部位，CD68陽性者標記為巨噬細胞。Con組大鼠心肌組織中僅有數(shù)個CD68陽性細胞[(1.5±0.24)個/視野]，MC組大鼠心肌組織中CD68陽性細胞數(shù)較Con組顯著增加[(34±6.2)個/視野，P=0.000 59]；與MC組相比，MC+Res組大鼠心肌組織中CD68陽性細胞浸潤程度顯著減輕[(14±3.8)個/視野，P=0.028]，差異均具有統(tǒng)計學意義(圖3)。

2.5 各組大鼠心肌組織MIF蛋白Western blot檢測結(jié)果 采用Western blot進一步明確MIF在各組心肌組織中的蛋白表達：MC組大鼠心肌組織中MIF蛋白較Con組顯著增加(P=0.006 8)，MC+Res組中MIF蛋白表達較MC組顯著降低(P=0.029)，差異具有統(tǒng)計學意義。因此，白藜蘆醇可降低EAM大鼠心肌組織中MIF的表達(圖4)。

圖3 各組大鼠心肌組織巨噬細胞表面標記分子CD68的表達變化

Fig.3 The expression of CD68 in the myocardium of rats (×200)

深棕黃色為CD68表達陽性細胞；A：對照組；B：模型組；C：白藜蘆醇干預組；D：CD68陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析；與對照組比較：***P<0.001；與模型組比較：#P<0.05。

圖4 各組大鼠心肌組織中MIF蛋白的表達

Fig.4 Expression of MIF in the myocardium of rats

A：各組大鼠心肌中MIF蛋白條帶；B：Western blot條帶灰度值統(tǒng)計分析；與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

3 討 論

白藜蘆醇作為一種天然植物抗毒素，廣泛存在于花生、紅葡萄和漿果類等植物果實中，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、舒張血管、防止心肌纖維化等多種功效[7]；YOSHIDA等[8]以及本課題組前期研究表明，白藜蘆醇對EAM有明顯的治療作用。本研究以豬心肌肌球蛋白免疫Lewis大鼠成功建立自身免疫性心肌炎模型，并給予白藜蘆醇灌胃治療。結(jié)果初步證明MIF在EAM大鼠心肌組織中高表達，白藜蘆醇干預能夠明顯降低MIF的表達，并且減少與其相關的巨噬細胞在心肌組織中的浸潤，并進一步減輕EAM大鼠心肌病理損傷，緩解EAM大鼠心功能障礙。

巨噬細胞因其具有分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子和促炎因子的功能在固有免疫應答中發(fā)揮著重要的作用。同時，巨噬細胞的過度激活與敗血癥、自身免疫性疾病及肉芽腫形成和發(fā)生有關[9]。在病毒性心肌炎實驗研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的浸潤及分型、與之相關的不同炎癥因子分泌決定了不同性別小鼠心肌組織炎癥程度的差異[10]；另外，在自身免疫性心肌炎大鼠心肌中，巨噬細胞占到浸潤炎癥細胞總數(shù)的70%以上[11]，參與EAM的發(fā)病。G?SER等[12]在自身免疫性心肌炎動物模型的心肌組織中，通過阻斷MCP-1及MIP-1α能夠明顯減少巨噬細胞浸潤，有效緩解疾病的嚴重程度；與上述研究一致，我們以CD68標記巨噬細胞，通過用免疫組化方法檢測到在免疫后第21天，EAM大鼠心肌組織中有大量巨噬細胞浸潤，并伴有嚴重心肌損傷和心功能障礙。MIF作為巨噬細胞分泌的主要炎癥因子，不僅可以調(diào)節(jié)T細胞活化與增殖，而且具有抑制巨噬細胞自由遷移的作用。MIF可以通過抑制P53表達減少凋亡，維持巨噬細胞活力以及促炎功能[13]。相反，BERNHAGEN等[14]用中和抗體阻斷MIF的受體CXCR2能減少T細胞和巨噬細胞的浸潤，并減緩動脈粥樣硬化的進展；同樣地，MATSUI等[15]證明抑制MIF可減少VCAM-1、TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，并且減少了活化T細胞與巨噬細胞的遷移。同時，巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-1β等炎癥因子，能進一步造成心肌細胞損傷、壞死、心肌纖維化等，與大鼠發(fā)生心衰甚至進展為DCM密切相關[16]。因此，我們推測，白藜蘆醇可能通過降低MIF表達及與其相關的巨噬細胞浸潤，進而對EAM大鼠心肌發(fā)揮治療作用。

綜上所述，白藜蘆醇能夠在一定程度上緩解EAM，可能與降低MIF的表達，進一步減少心肌組織中巨噬細胞浸潤，同時抑制巨噬細胞的促炎功能有關。盡管本研究證實了白藜蘆醇能降低MIF的表達，減少巨噬細胞浸潤，但MIF調(diào)節(jié)巨噬細胞以及相關炎癥應答的具體機制尚待明確。本研究有助于完善EAM的發(fā)病機制，為進一步尋找心肌炎的臨床治療策略提供理論基礎。

[1] DINY NL, BALDEVIANO GC, TALOR MV, et al. Eosinophil-derived IL-4 drives progression of myocarditis to inflammatory dilated cardiomyopathy[J]. J Exp Med, 2017, 214(4):943.

[2] TISTAM PV, QI D, LIN L, et al. MIF family cytokines in cardiovascular diseases and prospects for precision-based therapeutics[J]. Exp Opin Ther Tar, 2017, 21(7):671.

[3] MEZAROMERO R, BENEDEK G, YU X, et al. HLA-DRα1 constructs block CD74 expression and MIF effects in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol, 2014, 192(9):4164.

[4] BDALLAH AM, Al-MAZROEA AH, AL-HARBI WN, et al. Impact of MIF gene promoter variations on risk of rheumatic heart disease and its age of onset in Saudi Arabian patients[J]. Front Immunol, 2016, 7(15-16).

[5] TRIPATHI, MANISH, ASATI, et al. P-157 YI elevated macrophage migration inhibitory factor sera level in ulcerative colitis patients[J]. Inflamm Bowel Dis, 2016, 22: S57.

[6] HAO E, LANG F, CHEN Y, et al. Resveratrol alleviates endotoxin-induced myocardial toxicity via the Nrf2 transcription factor[J]. PLoS One, 2013, 8(7):e69452.

[7] PARK EJ, PEZZUTO JM. The pharmacology of resveratrol in animals and humans[J]. BBA-Mol Basis Dis, 2015, 1852(6):1071-1113.

[8] YOSHIDA Y, SHIOI T, IZUMI T. Resveratrol ameliorates experimental autoimmune myocarditis[J]. Circ J, 2007, 71(3):397-404.

[9] NAVEGANTES KC, GOMES RS, CZAIKOSKI PG, et al. Immune modulation of some autoimmune diseases: The critical role of macrophages and neutrophils in the innate and adaptive immunity[J]. J Trans Med, 2017, 15(1):36.

[10] KANG L, WEI X, QIANG G, et al. Differential macrophage polarization in male and female BALB/c mice infected with coxsackievirus B3 defines susceptibility to viral myocarditis[J]. Circ Res, 2009, 105(4):353-364.

[11] PUMMERER C, BERGER P, FRUHWIRTH M, et al. Cellular infiltrate, major histocompatibility antigen expression and immunopathogenic mechanisms in cardiac myosin-induced myocarditis[J]. Lab Invest, 1991, 65(5):538-547.

[12] G?SER S, ?TTL R, BRODENR A, et al. Critical role for monocyte chemoattractant protein-1 and macrophage inflammatory protein-1α in induction of experimental autoimmune myocarditis and effective anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy[J]. Circulation, 2005, 112(22): 3400-3407.

[13] BROCK SE, RENDON BE, XIN D, et al. MIF Family members cooperatively inhibit P53 expression and activity[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e99795.

[14] BERNHAGEN J, KROHN R, LUE H, et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment[J]. Nat Med, 2007, 13(5):587-596.

[15] MATSUI Y, OKAMOTO H, JIA N, et al. Blockade of macrophage migration inhibitory factor ameliorates experimental autoimmune myocarditis[J]. J Mol Cell Cardio, 2004, 37(2):557-566.

[16] ESKANDARI V, AMIIRZARGAR AA, MAHMOUDI MJ, et al. Gene expression and levels of IL-6 and TNFα in PBMCs correlate with severity and functional class in patients with chronic heart failure[J]. Iri J Med Sci, 2017, (13):1-10.