亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        硒蛋白S截短和全長重組質(zhì)粒的構建與表達

        2018-02-27 11:37:03黃芙萌馬芳霞田李芳

        黃芙萌,趙 莉,馬芳霞,陳 釗,王 莉,田李芳

        (西安交通大學第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,陜西西安 710004)

        硒(selenium, Se)是多種生物體內(nèi)不可缺少的微量元素。硒以硒蛋白形式在體內(nèi)發(fā)揮其生物學功能[1]。硒蛋白的特征為蛋白中都有硒代半胱氨酸(selenocysteine, Sec),人體內(nèi)共有25種硒蛋白基因,編碼超過30種硒蛋白[2]。硒蛋白S(SelS)是硒蛋白家族的主要成員,具有抗氧化損傷,參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及炎癥反應,參與精子發(fā)育過程等多方面的生物學功能[3]。人類SelS基因位于15號染色體長臂上,其mRNA有2個轉(zhuǎn)錄變體,分別由1 250和1 292個堿基組成,它們均能編碼由189個氨基酸殘基組成的 SelS,其中第188位為Sec殘基,是肽鏈中倒數(shù)第2位的氨基酸[4]。

        Se元素以Sec的形式插入硒蛋白,此過程需要一個能將mRNA中的UGA密碼子翻譯成Sec的特殊機制,在硒蛋白mRNA 3′端非翻譯區(qū)域(3′TUR)中存在一個莖環(huán)結構硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence, SECIS),該結構在翻譯過程中能使絲氨酰-tRNA上的反密碼子ACU與密碼子UGA交錯配對[5]。在Sec特異性延長因子、SECIS結合蛋白2(SECIS binding protein 2, SBP2)、核糖體蛋白L30、RNA結合蛋白、可溶性肝臟抗原蛋白和硒磷酸合酶1的輔助下,將Sec-tRNASec上攜帶的Sec插入到硒蛋白肽鏈中[6]。

        硒蛋白作為機體內(nèi)硒的最主要代謝形式,在硒缺乏與否的情況下存在兩種剪接方式:一種是將UGA翻譯為Sec插入硒蛋白肽鏈中,另一種是UGA作為終止密碼子終止硒蛋白肽鏈的翻譯。后者發(fā)生在細胞環(huán)境中缺乏合成原料硒時,硒蛋白的合成受到限制,而選擇將UGA作為終止密碼子終止硒蛋白肽鏈的翻譯,不再插入Sec,形成羧基端缺失-Sec-Gly、無酶活性、截短的硒蛋白[7]。

        本研究將模擬硒缺乏環(huán)境,構建能翻譯出截短 SelS的重組質(zhì)粒,同時構建其具有正常生物活性的全長 SelS的重組質(zhì)粒,用于后續(xù)實驗,以期觀察硒蛋白S截短體和完整形式在細胞系或動物體內(nèi)高表達的生物學效應。

        1 材料與方法

        1.1 材料 本實驗在西安交通大學生物化學與分子生物學系實驗室完成。pEGFP-C1真核表達載體、人宮頸癌細胞Hela細胞系及DH5α大腸桿菌菌種由本實驗室留存。高保真Taq酶及DNA marker購于日本TaKaRa公司,PCR primers由北京三博志遠公司合成,RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、ApaⅠ酶及XhoⅠ酶購于加拿大Fermentas公司,Gel Extraction System B VER2.0試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司,T4 DNA連接酶購于美國Sigma公司,TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒購自北京天根生物技術公司,胰蛋白胨及酵母提取物購于英國Oxoid公司,DMEM高糖培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物試劑,胎牛血清及胰蛋白酶購自美國HyClone公司,Lipofectamine 2000及Trizol?Reagent購自美國Invitrogen公司,E.Z.N.A. Fastfilter Endo-Free Plasmia Midi Kit購于OMEGA生物技術公司,6孔板購于美國Corning公司,倒置相差顯微鏡及正置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司,流式細胞儀(FACS)購于美國Guava Technologies公司。

        1.2 SelS基因PCR引物的設計與合成 截短的SelS用trun-S表示。trun-S中PCR的目的基因片段為CDS部分,不包括5′UTR或者3′TUR;全長SelS中PCR的目的基因片段為CDS+3′TUR部分,不包括5′UTR,3′TUR中含有SECIS序列。設計引物時,先在GenBank上查找出基因序列GenBank No.NM_018445.4,然后利用PRIMER-v5軟件進行設計,引物設計好之后在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST 進行查詢,確定與其他基因無同源性,為特異性序列。設計時引物的上下游分別引入與載體相應的內(nèi)切酶位點,上游用核酸內(nèi)切酶XhoⅠ,其識別序列為CTCGAG,下游用核酸內(nèi)切酶ApaⅠ,其識別序列為GGGCCC。PCR引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成(表1)。

        表1 硒蛋白PCR引物信息

        Tab.1 Primer information of selenoproteins

        基因引物序列(5'~3')擴增長度(bp)退火溫度(℃)SelS正義鏈CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGG反義鏈GCGGGCCCTTAATATACAGAAACAAACCCCATC103460trun-SelS正義鏈CCGCTCGAGATGGAACGCCAAGAGGAGTC反義鏈GCGGGCCCTTAGCCTCATCCGCCAG58759

        1.3 表達載體的選擇 在表達載體pEGFP-C1的多克隆酶切位點上,選擇與SelS基因兩端對應的核酸內(nèi)切酶位點XhoⅠ及ApaⅠ,兩酶切位點之間的序列將被切除,插入本研究的目的SelS基因片段(圖1)。

        圖1 pEGFP-C1載體結構和多克隆位點示意圖

        Fig.1 Schematic diagram of pEGFP-C1and its multiple cloning site

        1.4 重組質(zhì)粒的構建 建立PCR反應體系:5×Taq酶buffer 10 μL,正義鏈引物P1 1 μL,反義鏈引物P2 1 μL,模板0.5 μL,高保真Taq酶0.5 μL,dNTP 4 μL,ddH2O 33 μL。PCR反應條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 45 s,退火溫度45 s,72 ℃ 1 min,34個循環(huán)后,72 ℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確定DNA大小為目的條帶并且無其他雜帶。

        用Gel Extraction System B VER2.0試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收。建立50 μL雙酶切目的DNA片段的反應體系:XhoⅠ 2 μL,ApaⅠ 2 μL,10×Tango buffer 5 μL,DNA片段20 μL,H2O 21 μL;建立40 μL雙酶切載體的反應體系:XhoⅠ 1.6 μL,ApaⅠ 1.6 μL,10×Tango buffer 4 μL,DNA片段10 μL,H2O 22.8 μL。分別于37 ℃水浴6 h。將雙酶切獲取的目的DNA片段和載體按照上述的膠回收方法回收。建立20 μL連接反應體系:DNA片段8 μL,載體4 μL,T4 DNA連接酶1 μL,10×連接buffer 2 μL,H2O 5 μL,于16 ℃水浴連接過夜。

        1.5 轉(zhuǎn)化及克隆的鑒定 常規(guī)方法制備感受態(tài)DH5α大腸桿菌,將5 μL連接產(chǎn)物加入200 μL感受態(tài)細胞過夜培養(yǎng)。第2天用滅菌牙簽挑起LB平板上長出的單克隆菌落,移至5 mL LB培養(yǎng)液(含卡納霉素)中,37 ℃搖菌過夜。存菌種1 mL。用TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取擴增好的質(zhì)粒,進一步做目的硒蛋白基因的PCR擴增,再用瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組質(zhì)粒中目的硒蛋白基因的轉(zhuǎn)入情況。將已存的500 μL菌液送去公司測序。將測序返回的結果輸入NCBI的BLAST軟件進行比對。

        1.6 轉(zhuǎn)染表達及效率檢測 DMEM高糖培養(yǎng)基加100 mL/L胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)人宮頸癌Hela細胞。轉(zhuǎn)染時將實驗設計為4組,分別為Mock組、空載體對照組、trun-SelS組、SelS組,每組設3個平行孔,整個實驗共計12孔。6孔板中每孔接種2×105個懸浮在2 mL培養(yǎng)液中的細胞,接種24 h后細胞完全貼壁,當細胞融合度約80%時,每孔加入2 mL不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基;取無菌EP管1個,分別加入脂質(zhì)體5 μL和質(zhì)粒DNA 2 μg,加入無血清培養(yǎng)基,使之總體積為500 μL,混勻后37 ℃孵育20 min后加入每孔細胞中,5 h后吸出培養(yǎng)液棄掉,每孔加入2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后數(shù)小時,將6孔板直接放在倒置熒光顯微鏡下觀察,能觀察到綠色熒光與目的基因的融合蛋白開始表達,轉(zhuǎn)染后24 h后,用2.5 g/L胰酶消化細胞,PBS重新懸浮細胞,調(diào)整細胞密度大約為5×105/mL左右,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

        1.7 目的基因表達的鑒定 Trizol法提取細胞中的總RNA。在微量核酸/蛋白定量儀上定量,10 g/L瓊脂糖凝膠鑒定質(zhì)量。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以此為模板,用上述PCR體系對所轉(zhuǎn)染的硒蛋白基因進行擴增,并10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

        2 結 果

        2.1 SelS基因克隆的鑒定結果 構建了SelS和trun-SelS基因的克隆,瓊脂糖電泳凝膠圖顯示(圖2),重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,均釋放出了與目的硒蛋白DNA片段大小一致的DNA片段和載體pEGFP-C1,與測序結果的BLAST比對并確定插入片段堿基無缺失、無插入、無突變,一致率為100%,說明目的克隆已被成功構建。

        圖2 SelS和trun-SelS基因重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖

        Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids of selenoprotein S genes

        M:DNA marker(D2000);1:trun-SelS的PCR產(chǎn)物;2:trun-SelS重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物;3:為SelS的PCR產(chǎn)物;4:SelS重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。

        2.2 轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達 轉(zhuǎn)染trun-SelS和SelS 24 h后,綠色熒光蛋白表達很好(圖3),將細胞消化后上流式細胞儀檢測,轉(zhuǎn)染效率達到40%以上。這說明目的蛋白成功表達。

        2.3 轉(zhuǎn)染24 h時RT-PCR檢測目的硒蛋白基因的表達情況 trun-SelS組和SelS組的PCR產(chǎn)物的電泳結果都出現(xiàn)了明顯的trun-SelS基因條帶,而mock組和空載體組由于目的基因拷貝數(shù)低,沒有出現(xiàn)明顯的目的條帶,說明轉(zhuǎn)染成功,即被轉(zhuǎn)染的細胞高表達了trun-SelS基因;由于SelS的基因片段中包含trun-SelS基因片段,所以在SelS組中也有trun-SelS基因片段的高表達;由于trun-SelS的基因片段中沒有完全包含SelS基因片段,所以PCR產(chǎn)物的電泳結果只有SelS組高表達了SelS目的基因,也說明了SelS組重組質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)染;4組PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)了明顯的內(nèi)參基因條帶,且灰度基本一致,說明4組12個樣品的均一性很好,比較是有意義的,結果真實可靠(圖4)。

        圖3 硒蛋白S截短和全長基因轉(zhuǎn)染進Hela細胞24 h綠色熒光蛋白的表達

        Fig.3 GFP expression of normal and truncated selenoprotein S genes at 24 hours after transfection into Hela cells

        A:細胞在光鏡下形態(tài);B:細胞在熒光顯微鏡下形態(tài)及綠色熒光蛋白的表達。

        這說明已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染了SelS截短和正常的基因構建體,并使目的基因在細胞系中得以高表達,可進一步觀察這些目的基因高表達后對細胞的生物學作用。

        3 討 論

        綠色熒光蛋白由于其易表達、分子質(zhì)量小、蛋白穩(wěn)定及對細胞無毒性等優(yōu)點, 是近年來在分子生物學中應用最廣泛的標記性蛋白質(zhì)之一。綠色熒光真核表達載體pEGFP-C1作為改良后的一種變體,更易于觀測和研究目的基因的表達、調(diào)控及其目的蛋白在生物體內(nèi)定位和信號轉(zhuǎn)導等。

        應用此載體,我們成功構建了SelS截短和正常的基因重組質(zhì)粒,截短體基因只包含mRNA的CDS,全長包括mRNA的CDS和3′UTR序列。在硒蛋白mRNA的3′TUR中存在SECIS,該結構在翻譯過程中能將UGA翻譯為Sec,硒蛋白中的硒都以Sec位于活性中心發(fā)揮其生物學作用[2]。所以,存在3′TUR的硒蛋白基因?qū)⒈磉_出正常的有酶活性的SelS,而僅含CDS序列的硒蛋白基因?qū)⒈磉_出羧基端缺失-Sec-Gly的無酶活性的截短SelS。

        圖4 轉(zhuǎn)染硒蛋白S截短和全長基因后RT-PCR產(chǎn)物的的電泳結果

        Fig.4 RT-PCR results of normal and truncated selenoprotein S genes after plasmid transfection

        A圖中1~3:mock組;4~6:空載體組;7~9:trun-SelS組;10~12:SelS組;每組中設3個平行樣;B:內(nèi)參GAPDH。

        ABESTAL[8]做了有關截短硒蛋白的研究:利用化學技術去除掉蛋白質(zhì)肽鏈上最后兩個氨基酸-Sec-Gly,制作出截短的硒蛋白,然后測定其酶活性,發(fā)現(xiàn)截短硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)的自身酶活性與正常全長相比非常低,幾乎檢測不到,硒含量也接近無。研究者利用BioPORTER技術將這種截短的硒蛋白導入A549細胞后,發(fā)現(xiàn)其與具有正常酶活性TrxR1蛋白比較能引起細胞快速死亡,但機制不清[8]。此研究結果引起我們極大的興趣。日本學者又研究了TrxR2的剪接體,在其cDNA水平上編碼區(qū)有3個堿基的缺失、終止密碼子與3′UTR的SECIS之間有1228個堿基的插入。為了檢測其在細胞內(nèi)的功能,他們將此種截短的TrxR2剪接體轉(zhuǎn)染至Hela細胞系中并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄,表達出的截短的TrxR2能引起細胞凋亡,凋亡原因為NADPH的還原和細胞內(nèi)ROS水平的升高。此研究說明截短的硒蛋白在細胞生理病理中起著特殊的調(diào)節(jié)作用[9]。

        鑒于SelS在機體內(nèi)豐富的表達并有其重要的生物學功能,迄今為止還沒有研究通過基因重組將SelS的不同剪接體形式在細胞內(nèi)表達,而本研究通過將這兩種SelS的重組質(zhì)粒在靶細胞中表達,以便模擬正常和硒缺乏狀態(tài)下硒蛋白在機體內(nèi)的生物學效應,為進一步研究低硒或缺硒疾病的致病機制提供實驗基礎。

        [1] LU J, HOLMGREN A. Selenoproteins[J]. J Biol Chem, 2009, 284:723-727.

        [2] PAPP LV, LU J, HOLMGREN A, et al. From selenium to selenoproteins: Synthesis, identity, and their role in human health[J]. Antioxid Redox Signal, 2007, 9:775-806.

        [3] MISTRY HD, BROUGHTON PIPKIN F, REGMAN CW, et al. Selenium in reproductive health[J]. Am J Obstet Gynecol, 2012, 206:21-30.

        [4] LIN HC, HO SC, CHEN YY, et al. CRL2 aids elimination of truncated selenoproteins produced by failed UGA/Sec decoding[J]. Science, 2015, 349(6243):91-95.

        [5] HOWARD MT, CARLSON BA, ANDERSON CB, et al. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability[J]. J Biol Chem, 2013, 288:19401-19413.

        [6] MINIARD AC, MIDDLETON LM, BUDIMAN ME, et al. Nucleolin binds to a subset of selenoprotein mRNAs and regulates their expression[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38:4807-4820.

        [7] BUBENIK JL, MINIARD AC, DRISCOLL DM. Alternative transcripts and 3’UTR elements govern the incorporation of selenocysteine into selenoprotein S[J]. PLoS One, 2013, 8:e62102.

        [8] ABESTAL K, ARNER ES. Rapid induction of cell death by selenium-compromised thioredoxin reductase 1 but not by the fully active enzyme containing selenocysteine[J]. J Biol Chem, 2003, 278:15966-15972.

        [9] CHANG EY, SON SK, KO HS, et al. Induction of apoptosis by the overexpression of an alternative splicing variant of mitochondrial thioredoxin reductase[J]. Free Radic Biol Med, 2005, 39:1666-1675.

        精品蜜桃一区二区三区| 永久免费看啪啪网址入口| 少妇白浆高潮无码免费区| 亚洲AV无码永久在线观看| av二区三区在线观看| 亚洲女优中文字幕在线观看| 337p日本欧洲亚洲大胆精品| 日产精品久久久久久久| 91精品国产无码在线观看| 午夜蜜桃视频在线观看| 国产成人午夜福利在线观看| 亚洲精品中文字幕无码蜜桃| 国产日本在线视频| 综合成人亚洲网友偷自拍| 午夜成人理论福利片| 亚洲成a人片在线观看无码| 无码高潮久久一级一级喷水 | 91社区视频在线观看| 国产熟女乱综合一区二区三区| 日本人妻免费在线播放| 免费观看的a级毛片的网站| 伊人精品无码AV一区二区三区| 中文字幕人妻乱码在线| 国产区女主播在线观看 | 国产成人久久综合热| 亚洲av免费高清不卡| 亚洲乱码中文字幕在线| 国产精品免费观看久久| 亚洲国产成人AⅤ片在线观看| 人妻少妇中文字幕专区| 粗大的内捧猛烈进出看视频| 亚洲深深色噜噜狠狠爱网站| 天堂岛国精品在线观看一区二区| 国产av在线观看一区二区三区| 在线涩涩免费观看国产精品| 精品人妻VA出轨中文字幕| 后入少妇免费在线观看| 亚洲成av人片乱码色午夜| 女人色毛片女人色毛片18| 亚洲无码观看a| 色熟妇人妻久久中文字幕|