楊蕊銘，張慧云,2，鄭文嬌，王君靈，張澤南，何韶衡

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001； 2. 蘇州市相城人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215100； 3. 淄博礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東淄博 255120)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚疾病，影響10%～20%的人群[1]，任何年齡均可發(fā)病。嗜酸性粒細(xì)胞起源于骨髓CD34+造血祖細(xì)胞，與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞一樣，是參與過(guò)敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一。正常皮膚組織無(wú)嗜酸性粒細(xì)胞，而AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多，皮損處可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且其數(shù)量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。嗜酸性粒細(xì)胞在炎性分子和細(xì)胞因子的作用下可募集其它炎癥細(xì)胞進(jìn)而加重皮膚損傷[2]。上述研究提示，嗜酸性粒細(xì)胞與AD的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系。

P物質(zhì)(substance P, SP)是有特異性的神經(jīng)活性和促炎活性的神經(jīng)肽[3]。研究報(bào)道，AD鼠模型的皮膚受損部位SP+肥大細(xì)胞和神經(jīng)纖維細(xì)胞增多[4]；皮內(nèi)注射SP可誘導(dǎo)或加重正常人和AD患者皮膚的炎癥反應(yīng)，提示SP參與AD發(fā)病。NK1R是SP的高親和力受體，SP可通過(guò)激活NK1R增強(qiáng)皮膚的炎癥反應(yīng)[5-6]，濕疹患者外周血單核細(xì)胞、Th細(xì)胞、NKT細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞NK1R表達(dá)顯著升高[7]，AD患者NK1R+單核細(xì)胞增多[8]，提示SP可能通過(guò)NK1R參與AD發(fā)病。然而，目前尚無(wú)AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞SP和NK1R的表達(dá)的報(bào)道。

螨蟲(chóng)和植物花粉是室內(nèi)、外過(guò)敏原的主要來(lái)源，通過(guò)與致敏的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE-FcεRⅠ復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)可誘導(dǎo)過(guò)敏性疾病的發(fā)生[9]。有報(bào)道稱塵螨過(guò)敏原可誘導(dǎo)AD的發(fā)生。OVA激發(fā)鼠支氣管后，其肺組織的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SP顯著增多[10]，說(shuō)明過(guò)敏原可誘導(dǎo)SP的表達(dá)。但是目前尚無(wú)過(guò)敏原對(duì)AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞SP和NK1R表達(dá)影響的研究。因此，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AD患者外周血SP和NK1R在嗜酸性粒細(xì)胞富集群中的表達(dá)情況，及塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過(guò)敏原對(duì)SP和NK1R表達(dá)的影響，旨在為SP、NK1R與嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 蒿草花粉提取液、屋塵螨提取液和梧桐花粉粗提液(北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)限責(zé)任公司，中國(guó))，BV421耦合的鼠抗人CCR3、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細(xì)胞去除染料)、FcR阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、BFA(Biolegend，美國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗人SP抗體(LifeSpan，美國(guó))，APC標(biāo)記鼠抗人NK1R抗體(R&D Systems，美國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔IgG同型抗體(eBioscience，美國(guó))，APC標(biāo)記鼠IgG3同型抗體(R&D Systems，美國(guó))，Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒(BD Biosciences，美國(guó))，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)過(guò)敏原試劑(ALK-ABELLO，丹麥)，其他常用的化學(xué)試劑均為分析級(jí)純度；低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientific，美國(guó))，水浴鍋(精宏，中國(guó))，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn) 募集錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科就診的AD患者和門診健康人為志愿者。對(duì)志愿者進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)，點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性的AD患者和點(diǎn)刺試驗(yàn)陰性的健康人為本研究的研究對(duì)象。共納入10位健康人和15例AD患者，AD診斷符合2016年發(fā)布的AD診斷指南[11]。本實(shí)驗(yàn)要求所有AD患者至少2周前停止服用抗過(guò)敏藥物。本研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，每位志愿者均簽訂了知情同意書(shū)。

1.2.2 收集血液樣本 采集研究對(duì)象的資料(表1)；每位研究對(duì)象均采集2 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

表1 志愿者的一般資料

Tab.1 General information of the volunteers

人群例數(shù)年齡(歲)女/男病史(年)發(fā)病年齡(歲)健康人1026(25～30)6/4 0 0AD患者1530(2～78)10/54(0.5～17)27(1.5～61) 花粉(+)449.5(36～52)3/15.5(5～10)44(26～47) 蒿草350(36～52)2/15(5～10)45(26～47) 梧桐1 491/0 6 43 螨蟲(chóng)(+)1 161/0 3 13 螨蟲(chóng)+花粉(+)1026.5(2～78)6/42.5(0.5～10)24.5(1.5～61) 螨蟲(chóng)+蒿草621.5(2～78)2/42.5(0.5～17)16.5(1.5～61) 螨蟲(chóng)+梧桐829.5(2～78)6/23.5(0.5～17)27(1.5～61)

注：表中年齡、病史和發(fā)病年齡的描述均為中位數(shù)(極小值～極大值)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析血液中嗜酸性粒細(xì)胞富集群SP和NK1R的表達(dá) 全血加入塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過(guò)敏原粗提液(終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL和1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min離心后棄去上清，加入死細(xì)胞去除染料與FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，加入抗CCR3抗體，避光孵育15 min后裂解紅細(xì)胞，離心后用固定透膜液固定細(xì)胞，加入抗SP和抗NK1R抗體孵育，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP和NK1R的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)。Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)分析組間差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，用Mann-WhitneyU進(jìn)一步兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP表達(dá)降低 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群(設(shè)門方法見(jiàn)圖1)中SP的表達(dá)。結(jié)果顯示，AD患者的嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞的比例較健康對(duì)照組降低了1.17倍(P<0.001，圖2、圖3)，且AD患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞的MFI降低了55%(P<0.001，圖4、圖5)，而過(guò)敏原對(duì)SP的表達(dá)無(wú)影響(圖3、圖5)。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞富集群的設(shè)門方法

Fig.1 Gating strategies of eosinophil-enriched cells

A：細(xì)胞碎片去除后的細(xì)胞群；B：死細(xì)胞去除后的細(xì)胞群；C：細(xì)胞群；D：嗜酸性粒細(xì)胞富集群(CCR3+細(xì)胞群)。

圖2 AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞SP表達(dá)變化的流式細(xì)胞儀圖

Fig.2 Representative flow cytometric graphs of the expression of SP in eosinophils from human peripheral blood

Isotype：同型對(duì)照；HC：健康對(duì)照組；AD：特應(yīng)性皮炎。

圖3 人外周血中嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞的百分比

Fig.3 Percentage of SP+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對(duì)應(yīng)的健康人群比較，#P<0.001。

圖4 人外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中SP+細(xì)胞MFI的流式細(xì)胞儀圖

Fig.4 Representative flow cytometric graphs of MFI of SP+eosinophils in human peripheral blood

Isotype：同型對(duì)照；HC：健康對(duì)照組；AD：特異性皮炎。

2.2 AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中NK1R表達(dá)升高 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中NK1R的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖6、圖7)，與健康對(duì)照組相比，AD患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中NK1R細(xì)胞的比例升高了41%(P=0.001)，而過(guò)敏原對(duì)NK1R的表達(dá)無(wú)影響。

3 討 論

嗜酸性粒細(xì)胞是血液終末分化的粒細(xì)胞之一，可通過(guò)釋放趨化因子，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞募集而參與包括AD在內(nèi)的皮膚炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多，并與AD的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示嗜酸性粒細(xì)胞可能參與AD發(fā)病或募集皮損部位其他炎癥細(xì)胞共同參與AD的發(fā)病。

圖5 人外周血中嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞MFI的表達(dá)

Fig.5 MFI of NK1R+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對(duì)應(yīng)的健康人群比較，*P<0.001。

圖6 AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞NK1R表達(dá)變化的流式細(xì)胞儀圖

Fig.6 Representative flow cytometric graphs of the expression of NK1R in eosinophils from human blood

Isotype：同型對(duì)照；HC：健康對(duì)照組；AD：特應(yīng)性皮炎。

SP具有促炎性質(zhì)，能夠誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子和組胺的釋放并引起血管擴(kuò)張，進(jìn)而誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)[12]。SP來(lái)源廣泛，體內(nèi)的多種細(xì)胞包括神經(jīng)細(xì)胞和炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞均可分泌SP。研究發(fā)現(xiàn)皮膚病患者如慢性自發(fā)性蕁麻疹患者[13]、濕疹患者[7]、AD患者的血漿SP水平顯著升高[4,8,14]，嗜酸性粒細(xì)胞可分泌SP。因此，我們推斷升高的血漿SP水平可能來(lái)源于嗜酸性粒細(xì)胞，并進(jìn)一步探究了AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞SP的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞減少了1.17倍，SP+嗜酸性粒細(xì)胞的MFI降低了55%。由于AD患者血液嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，而中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等均可分泌SP，本研究結(jié)果提示可能嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的SP不是AD患者血漿SP的主要來(lái)源。升高的血漿SP水平可能與AD患者血液CD8+T細(xì)胞分泌SP增多有關(guān)[8]。

圖7 人外周血中嗜酸性粒細(xì)胞富集群中NK1R+細(xì)胞的百分比

Fig.7 Percentage of NK1R+eosinophils in human peripheral blood

蒿草：蒿草花粉粗提液；塵螨：塵螨粗提液；梧桐：梧桐花粉粗提液；與相對(duì)應(yīng)的健康人群比較，*P<0.001。

NK1R是神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織SP的高親和力受體[15]，研究發(fā)現(xiàn)SP/NK1R復(fù)合物是炎癥微環(huán)境重要的組成部分[16]，NK1R激動(dòng)劑在過(guò)敏原誘導(dǎo)的AD中起重要作用。NK1R敲除鼠和NK1R拮抗劑可抑制神經(jīng)-炎癥皮膚損傷、NK1R拮抗劑可以緩解慢性瘙癢[17]，提示NK1R參與AD的發(fā)病。本研究首次用流式細(xì)胞儀技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中NK1R+細(xì)胞的比例升高了41%，提示升高的血漿SP可能通過(guò)與嗜酸性粒細(xì)胞表面的NK1R結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)功能，SP/NK1R復(fù)合物在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。嗜酸性粒細(xì)胞是過(guò)敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一[12]，AD鼠模型SP+神經(jīng)纖維附近嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒和SP可激活人類嗜酸性粒細(xì)胞的報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)了我們的發(fā)現(xiàn)[18-19]。然而，AD患者嗜酸性粒細(xì)胞表面NK1R表達(dá)升高的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)塵螨、梧桐花粉和蒿草花粉過(guò)敏原對(duì)AD患者嗜酸性粒細(xì)胞SP和NK1R表達(dá)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能提示過(guò)敏原不是通過(guò)誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分泌SP或表達(dá)NK1R參與AD。由于塵螨過(guò)敏原、艾蒿花粉過(guò)敏原和梧桐花粉過(guò)敏原對(duì)AD患者外周血非嗜酸性粒細(xì)胞SP和NK1R的表達(dá)影響不同[8]，目前尚無(wú)過(guò)敏原調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)SP和NK1R的報(bào)道，因此過(guò)敏原調(diào)節(jié)SP和NK1R表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，更詳細(xì)的工作可能有助于發(fā)現(xiàn)潛在的機(jī)制。

總之，AD患者嗜酸性粒細(xì)胞NK1R表達(dá)增強(qiáng)，提示嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)的NK1R可能參與AD發(fā)病，NK1R的拮抗劑或阻斷劑可能是治療AD的有效制劑。

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