李蘇童，雷 潔，王娟紅，王琦俠，申 遠(yuǎn)，姜小健，田普訓(xùn)

(1. 西安市中心醫(yī)院腎病科，陜西西安 710003；2. 西安市中心醫(yī)院病理科，陜西西安 710003； 3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部統(tǒng)計(jì)教研室，陜西西安 710061；4. 西安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科， 陜西西安 710003； 5.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科，陜西西安 710061)

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，廣泛參與了機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥、組織重塑、衰老等多種病理生理過程，不同表型的巨噬細(xì)胞發(fā)揮不同的免疫學(xué)作用。既往研究已發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞活化具有不均一性，可能有2種主要的極化模式：經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞M1和替代激活的巨噬細(xì)胞M2。M1和M2在免疫過程中有不同的病理生理作用，可能通過巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的一系列受體分子介導(dǎo)而發(fā)揮作用，其分子受體包括了活化性受體和抑制性受體[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β1, TGF-β1)通路廣泛參與了巨噬細(xì)胞極化過程，而RUNX3是TGF-β1通路中的關(guān)鍵分子。RUNX3作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)包括PIR-A/B在內(nèi)的多種靶分子的轉(zhuǎn)錄與活化過程[2]。本研究通過沉默RAW264.7 RUNX3并檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞分泌因子的變化，初步探討RUNX3 在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7細(xì)胞系和mRTEC細(xì)胞系均購自武漢巴菲爾生物技術(shù)公司；胎牛血清購自Gibco公司；RPMI1640購自Gibco公司；羊抗鼠RUNX3多克隆抗體、兔抗鼠E-cadherin多克隆抗體、兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)多克隆抗體、羊抗鼠β-actin單克隆抗體(mAb)購于Sigma公司；CD86、arginase-1、iNOS抗體購自BD公司；HRP標(biāo)記的抗兔IgG、HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及刺激分化和檢測(cè)

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及刺激分化 將RAW264.7(細(xì)胞數(shù)1×104)接種至6孔板，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h，光學(xué)顯微鏡下觀察照相；隨機(jī)分為M1組、M2組及對(duì)照組(M0組)，每組3孔。M1組刺激分化采用先加入IFN-γ(100 u/mL)刺激20 h，再追加LPS(100 μg/mL)刺激6 h；M2組刺激分化采用加IL-4(20 μg/mL)刺激26 h；對(duì)照組不更換培養(yǎng)液，同步化培養(yǎng)26 h，收取各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分組培養(yǎng)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 誘導(dǎo)生成的M1和M2 RAW264.7巨噬細(xì)胞中RUNX3的檢測(cè) 采用免疫熒光法檢測(cè)。將1.2.1中各組細(xì)胞按1×104接種至24孔板，同步化培養(yǎng)2 h，室溫PBS液洗滌2次，多聚甲醛(1 mL/孔)固定20 min，PBS洗5 min×3次；加PBST室溫孵育10 min；PBS洗滌5 min×3次；50 mL/L牛血清封閉1 h；加入兔抗鼠RUNX3單克隆抗體(1∶100)濕盒4 ℃過夜；吸除一抗，PBS洗5 min×3次；加入山羊抗兔熒光二抗(1∶50)室溫孵育1 h；PBS洗5 min×3次；加入DAPI (1 μg/mL)；避光5 min；PBS洗5 min×3次；抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡照相。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞RUNX3 mRNA的表達(dá) 分別提取各組(M1、M2、M0組)細(xì)胞RNA并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。內(nèi)參GAPDH引物分別為，正義5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′、反義5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′；RUNX3引物分別為，正義5′-GATGGCAGGCAATGACGA-3′，反義5′-TGCTGAAGTGGCTTGTGGT-3′，擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃變性5 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸12 s，45個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)M1組細(xì)胞iNOS和M2組細(xì)胞arginase-1 mRNA的表達(dá) 方法同1.2.3。iNOS引物分別為，正義5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCA-

GC-3′、反義5′-CCAAAGCCACGAGGCTCTGACAGCC-3′；arginase-1引物分別為，正義5′-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3′、反義5′-GGTGA-

CTCCCTGCATATCTG-3′。

1.3 siRNA載體的構(gòu)建及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank已知人RUNX3 基因序列設(shè)計(jì)siRNA：TGACGAGAACTACTCCGCT。合成編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，正義鏈RUNX3-F：5′-GATCCTGACGA-GAACTACTCCGCTTTCAAGAGAAGCGGAGT-AGTTCTCGTCATTTTTTGGAAA-3′，反義鏈RUNX3-R：5′-AGCTTTTCCAAAAAATGACGA-GAACTACTCCGCTTCTCTTGAAAGCGGAGT-

AGTTCTCGTCAG-3′。據(jù)此序列合成雙鏈DNA，55 ℃退火，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，擴(kuò)增后得到重組質(zhì)粒RUNX3-siRNA。

將正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)1×104)接種至6孔板，貼壁細(xì)胞達(dá)70%底板面積時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔加1 mL無血清DMEM，洗滌1次，棄去。100 mL無血清培養(yǎng)液稀釋0.8～1.0 μg(6 μL)質(zhì)粒作為空載體對(duì)照；100 mL無血清培養(yǎng)液稀釋6 μL LipofectamineTM2000，室溫下放置5 min后，將其與相應(yīng)質(zhì)?；旌?，室溫下放置30 min，將此混合物200 μL加入6孔板，每孔加入0.8 mL無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h，每孔加入1 mL含250 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后加入G418選擇性培養(yǎng)基(選用400 mg/L進(jìn)行篩選)篩選轉(zhuǎn)染克隆。沉默RUNX3基因的RAW264.7細(xì)胞系克隆株和正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞分別命名為RAW264.7-siRUNX3和RAW264.7-cont，分別用RT-PCR法和Western blot檢測(cè)RUNX3的表達(dá)情況以進(jìn)行鑒定。RT-PCR方法同1.2.3；Western blot：用Bradford法測(cè)定各組蛋白濃度，每孔10 μL上樣，100 g/L SDS聚丙酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色標(biāo)記，100 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加50 g/L脫脂奶粉稀釋的一抗(兔抗鼠RUNX3多克隆抗體，1∶200稀釋)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入50 mL/L脫脂奶粉稀釋二抗(HRP標(biāo)記的抗兔IgG，1∶400稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜3次，ECL顯影。

1.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平 收集RAW264.7-siRUNX3和RAW264.7-cont組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒操作說明，測(cè)定各組細(xì)胞TNF-α的分泌水平，全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm 處讀取吸光度值。

1.5 RT-PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)染克隆中iNOS和CD86的mRNA表達(dá) 分別提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RNA并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。方法同1.2.3。CD86引物分別為，正義5′-TCAGTCAGGATGGGAGTGGTA-3′，反義5′-ATCCAAGAGCCATTCCTACCT-3′。

2 結(jié) 果

2.1 IFN-γ、LPS共刺激RAW264.7細(xì)胞iNOS的表達(dá)變化和IL-4刺激RAW264.7細(xì)胞arginase-1的表達(dá)變化 IFN-γ、LPS共刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后提取總RNA，使用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與M0組(4.69±0.96)相比，M1組(1.13±0.25)iNOS表達(dá)明顯減少(P=0.002)；而通過IL-4刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后arginase-1表達(dá)升高，分別為M0組(2.09±0.2)，M2組(13.28±1.1) (P=0.021，圖1)。這提示IFN-γ、LPS共刺激促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化，而IL-4刺激RAW264.7細(xì)胞向M2型極化。

圖1 INF-γ和LPS刺激或IL-4刺激RAW264.7細(xì)胞后iNOS和arginase-1的mRNA表達(dá)變化

Fig.1 The mRNA expressions of iNOS and arginase-1 in RAW264.7 cells stimulated by INF-gamma and LPS or stimulated by IL-4

與對(duì)照組(RAW264.7組)相比，*P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞(M0、M1、M2)RAW264.7 RUNX3的表達(dá)

2.2.1 各組細(xì)胞RUNX3免疫熒光染色結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察到，M1組細(xì)胞呈多邊形，觸角較多，細(xì)胞較大；而M2組細(xì)胞較小，形狀偏圓形，觸角較少；RUNX3是一種核轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于RAW264.7核膜部位；與M0組比較，M2組熒光較弱，而M1組熒光較強(qiáng)，并且M1組RUNX3熒光明顯較M2組亮(圖2)。

2.2.2 各組細(xì)胞RUNX3 mRNA的檢測(cè)結(jié)果 與M0組(0.86±0.08)相比，M1組RUNX3 mRNA表達(dá)增高(1.16±0.37)(P=0.001)，M2組表達(dá)相比降低(0.53±0.1)(P=0.041)，而M1較M2組RUNX3 mRNA高表達(dá)(P<0.001，圖3)。

2.3 RUNX3低表達(dá)細(xì)胞模型的建立 經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和G418培養(yǎng)篩選，獲得細(xì)胞系RAW264.7-siRUNX3和 RAW264.7-cont。PCR結(jié)果顯示，RUNX3在RAW264.7-siRUNX3細(xì)胞中的表達(dá)(0.26±0.06)低于RAW264.7-cont組細(xì)胞(0.86±0.07)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RUNX3在RAW264.7-siRUNX3細(xì)胞中的表達(dá)低于RAW264.7-cont組細(xì)胞(圖4)。提示獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的低表達(dá)RUNX3的RAW264.7 細(xì)胞系。

圖2 M1型和M2型巨噬細(xì)胞RUNX3免疫熒光染色結(jié)果

Fig.2 RUNX3 immunofluorescence staining results of M1 and M2 macrophages (×400)

圖3 M1型和M2型巨噬細(xì)胞RUNX3 mRNA的表達(dá)

Fig.3 RUNX3 mRNA expressions in M1 and M2 macrophages

RUNX3 mRNA水平在M1中表達(dá)最高(P=0.001)，M0中表達(dá)水平次之，而M2中表達(dá)最低(P=0.041)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 PCR和Western blot檢測(cè)RUNX3-siRNA轉(zhuǎn)染后RAW264.7中RUNX3的mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)

Fig.4 mRNA and protein expressions of RUNX3 in RUNX3-siRNA transfected RAW264.7 detected by PCR (A) and Western blot (B)

與RAW264.7-cont組比較，P<0.05(P=0.036)。

2.4 RAW264.7-siRUNX3抑制RAW264.7細(xì)胞 iNOS和CD86 mRNA表達(dá) RAW264.7-siRUNX3組iNOS(0.61±0.13)較RAW264.7-cont表達(dá)降低(2.96±0.19)(P<0.001)；CD86 mRNA表達(dá)(0.67±0.09)較RAW264.7-cont組降低(4.72±0.38)(P=0.005，圖5)。

圖5 RAW264.7-siRUNX3抑制RAW264.7 iNOS(A)和CD86(B)mRNA的表達(dá)

Fig.5 RAW264.7-siRUNX3 inhibited the mRNA expressions of RAW264.7 iNOS (A) and CD86 (B)

與RAW264.7-cont組相比，RAW 264.7-siRUNX3組細(xì)胞iNOS(P<0.001)和CD86(P=0.005)表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 RUNX3低表達(dá)RAW264.7分泌的TNF-α變化 與RAW264.7-cont組(55.11±4.32)相比，RAW264.7-siRUNX3組培養(yǎng)液中TNF-α含量(34.8±4.29)較低(P<0.001，圖6)，這說明RUNX3低表達(dá)抑制了TNF-α的分泌。

3 討 論

巨噬細(xì)胞是具有高度異質(zhì)性的固有免疫細(xì)胞，其激活形式多種多樣，稱為巨噬細(xì)胞極化(polarization)，不同極化方式的巨噬細(xì)胞發(fā)揮著完全不同的免疫學(xué)作用。現(xiàn)有的研究將巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典活化型(M1)和選擇活化型(M2)。在不同的微環(huán)境下M0可分化成為M1或者M(jìn)2，發(fā)揮不同的免疫作用。M1型巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，釋放炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生；而M2型巨噬細(xì)胞抑制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)。不同的信號(hào)通路以及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄活化因子、干擾調(diào)節(jié)因子、核因子、激活蛋白等都參與了巨噬細(xì)胞極化過程。近些年的研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路除了在傳統(tǒng)胚胎發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用以外，還參與了多種炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)[3]。Wnt信號(hào)通路同樣也參與了巨噬細(xì)胞極化過程，研究結(jié)核病的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)Wnt6上調(diào)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化[4]；而Wnt5a低表達(dá)也能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向極化[5]。動(dòng)物來源的原代巨噬細(xì)胞增殖困難，不利于進(jìn)行基因敲除等實(shí)驗(yàn)研究，因此，本研究選用巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7作為分子生物學(xué)研究對(duì)象，并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了IFN-γ和LPS刺激促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向M1亞型極化，而IL-4促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向M2亞型極化，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符合。

圖6 RUNX3低表達(dá)抑制RAW264.7 TNF-α分泌

Fig.6 The low expression of RUNX3 inhibited the TNF-α secretion in RAW264.7

與RAW264.7-cont比較，*P<0.001。

RUNX3屬于轉(zhuǎn)錄因子中runt結(jié)構(gòu)域家族，是一種器官組織發(fā)育過程中重要的核轉(zhuǎn)錄因子；RUNX3能夠調(diào)控多種基因表達(dá)，并且參與了Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程。在胃癌相關(guān)的研究中，有學(xué)者認(rèn)為RUNX3能夠通過調(diào)控TCF4/β-catenin結(jié)合而正向或者負(fù)向調(diào)控Wnt通路激活[6]。本研究通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)直觀觀察到RUNX3在RAW264.7刺激極化形成的M1和M2細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)弱不同，而通過RT-PCR的定量結(jié)果，也證實(shí)了RUNX3在RAW264.7刺激極化形成的M2細(xì)胞中表達(dá)高于M1。PIR-B是RUNX3的靶分子之一，在B淋巴細(xì)胞中，RUNX3和PU.1共同調(diào)控B細(xì)胞表面PIR-B受體的表達(dá)；PIR-B是表達(dá)在多種免疫細(xì)胞表面的抑制性受體。研究證實(shí)，M1型巨噬細(xì)胞表面PIR-B受體表達(dá)顯著降低，而M2型巨噬細(xì)胞表面PIR-B受體

表達(dá)明顯增高[7]；另有研究證實(shí)RUNX3在巨噬細(xì)胞極化的過程中調(diào)節(jié)粘附分子的表達(dá)[8]；而TGF-β、Wnt通路明確參與了巨噬細(xì)胞極化過程，而RUNX3與巨噬細(xì)胞極化是何種關(guān)系尚不清楚。對(duì)此，本研究敲除了RAW264.7巨噬細(xì)胞的RUNX3基因，建立了RUNX3低表達(dá)細(xì)胞模型，通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細(xì)胞表面M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記分子iNOS和CD86 mRNA表達(dá)有所下降；雖然與對(duì)照組相比TNF-α的分泌量顯著下降，但仍有部分分泌量，這表明，敲除了RUNX3的巨噬細(xì)胞有向M1方向極化的趨勢(shì)，RUNX3可能部分參與了巨噬細(xì)胞極化的過程。不同類型的巨噬細(xì)胞在纖維化消解、創(chuàng)傷修復(fù)、移植免疫排斥、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中發(fā)揮著截然不同的重要作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化是治療臟器纖維化、創(chuàng)傷修復(fù)、自身免疫性及炎癥性疾病新的重要切入點(diǎn)，本研究為這些疾病治療提供了可能的新靶點(diǎn)。

[1] MARTINEZ FO. Regulators of macrophage activation[J]. Eur J Immunol, 2011, 1(6):1531-1534.

[2] DONG CS, ZHAO GP, ZHONG M, et al. RNA sequencing and transcriptomal analysis of human monocyte to macrophage differentiation[J]. Gene, 2013, 519(2):279-287.

[3] ZHOU D, HUANG C, LIN Z, et al. Macrophage polarization and function with emphasis on the evolving roles of coordinated regulation of cellular signaling pathways[J]. Cell Signal, 2014, 26(2):192-197.

[4] SCHAALE K1, BRANDENBURG J, KISPERT A, et al. Wnt6 is expressed in granulomatous lesions of mycobacterium tuberculosis-infected mice and is involved in macrophage differentiation and proliferation[J]. J Immunol, 2013, 191(10):5182-5195.

[5] CHEN D, LI G, FU X, et al. Wnt5a deficiency regulates inflammatory cytokine secretion, polarization, and apoptosis in mycobacterium tuberculosis-infected macrophages[J]. DNA Cell Biol, 2017, 36(1):58-66.

[6] JU X, ISHIKAWA TO, NAKA K, et al. Context-dependent activation of Wnt signaling by tumor suppressor RUNX3 in gastric cancer cells[J]. Cancer Sci, 2014, 105(4):418-424.

[7] ARITA K, ENDO S, KAIFU T, et al. Transcriptional activation of the Pirb gene in B cells by PU.1 and Runx3[J]. J Immunol, 2011,186(12):7050-7059.

[8] ESTECHA A, AUILERA-MONTTILLA N, SANCHEZ-MATEOS P. RUNX3 regulates intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3) expression during macrophage differentiation and monocyte extravasation[J]. PLoS One, 2012;7(3):e33313.