宋 敏，鞏彥龍，劉 濤，劉建鴻，董萬濤，劉小鈺，侯紅艷

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州 730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730000)

椎動脈型頸椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type, CSA)在中醫(yī)學屬于“眩暈”“項痹”的范疇，好發(fā)于中老年人，男性多于女性，其發(fā)病率約占頸椎病的20%～25%。其發(fā)病是由于頸椎出現(xiàn)不同程度的退化而導致椎-基底動脈狹窄[1]，供血量下降，引起顱內(nèi)供血不足，從而出現(xiàn)以眩暈為主要表現(xiàn)，伴有其他頸部及全身不適的臨床綜合征[2-3]。近年來，隨著人們生活方式改變，CSA的發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升的趨勢，并趨向于年輕化。下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axi, HPA軸)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(neuro-endocrine-immune, NEI)網(wǎng)絡的關(guān)鍵組成部分，與CSA的發(fā)病密切相關(guān)。當椎動脈局部受到刺激時，機體應激信息在大腦通過復雜的神經(jīng)通路激活HPA軸而改變機體的生理狀態(tài)[4]。在HPA軸的調(diào)控下CSA的發(fā)病機制極其復雜[5]，椎-基底動脈痙攣、血流量下降是CSA的基本發(fā)病機制，多種因素導致的椎動脈血管功能改變是CSA發(fā)生發(fā)展中的主要環(huán)節(jié)。研究基因調(diào)控對CSA的發(fā)病和治療具有重要價值。本研究通過建立CSA大鼠模型，并設置正常對照，應用基因芯片技術(shù)，分析正常組和模型組大鼠垂體組織基因表達譜特征，進而篩選差異表達的基因，從基因功能、信號通路等方面探討垂體對CSA模型大鼠的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 Trizol試劑和ds-cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司；單色DNA標記試劑盒購自美國Nimble Gen Systems公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自BioTNT公司；Affymetric HumangenomeU 133 plus2.0芯片購自Affymetrix公司；NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒購自MACHEREY-NAGEL(Germany)；PCR NucleoSpinExtract Ⅱ Kit(MN)和RNA Clean-up Kit(MN)購自上海浩然生物技術(shù)有限公司；T7 Oligo(dT)Primer上海賓智生物科技有限公司；注射用青霉素鈉160 U/支(華北制藥股份有限公司，批號：F5022318)；水合氯醛，規(guī)格100 g/瓶(上海展云化工有限公司，產(chǎn)品編號：CAS-302-170)。

1.2 實驗動物 雄性Wistar大鼠10只，10月齡，體質(zhì)量(300±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室[合格證號SCXK(甘)2011-0001]提供。每日給予充足的水和飼料，適應1周，24 h光照明暗各半，每3只飼養(yǎng)在同一籠中，每2 d更換1次墊料，已排除其他環(huán)境因素。

1.3 動物造模與分組 大鼠按體質(zhì)量隨機分為正常組和模型組。模型組動物均采用復合造模法(力學失衡法與植骨壓迫法相結(jié)合)[6]建立CSA大鼠模型；造模成功后兩組分別隨機取出4只進行基因芯片檢測。

1.4 組織取材 造模成功后分別解剖分離CSA模型組大鼠及正常組大鼠垂體組織，于液氮中速凍待送檢測。

1.5 RNA提取及純化 應用Trizol法提取大鼠垂體組織樣品中總RNA；使用NanoDropND-1000進行質(zhì)檢；根據(jù)RNeasy MiNi Protocol，使用QLAGENR Neasy?Kit純化Total RNA。

1.6 基因芯片檢測 應用Agilent mRNA大鼠全基因單通道表達譜芯片，由北京博奧生物技術(shù)有限公司進行實驗檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法 芯片數(shù)據(jù)由北京博奧生物技術(shù)有限公司生物芯片分析系統(tǒng)(MAS系統(tǒng))進行歸一化整理，對歸一化數(shù)據(jù)進行差異表達基因分析，將差異基因以上調(diào)及下調(diào)2倍為限，通過DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)網(wǎng)站整合的數(shù)據(jù)庫進行基因本體論(gene ontology, GO)、KEGG pathway分析差異基因在信號通路上的富集程度、分子功能和生物學過程；兩組組內(nèi)比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣品質(zhì)量控制 8個待測樣本中A260/280均在1.8～2.0之間，RNA總量≥1 μg，待測樣本符合芯片實驗要求(表1)。

經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性的結(jié)果顯示：有清晰可見的28S、18S條帶，12號RNA樣品28S∶18S rRNA條帶亮度略小于1∶1，樣品有輕微降解；其余RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近1∶1(圖1)。

2.2 基因表達譜分析

2.2.1 差異基因分析 基于R語言和BRB語言，模型組與正常組垂體組織之間的基因芯片表達數(shù)據(jù)進行差異基因的篩選，總共有203個基因上調(diào)、118個基因下調(diào)(圖2)，聚類分析熱圖中紅色方塊表示|fold change︱=2.205(>2)，OR方法修正后的P=0.017(≤0.05)的差異表達基因。

2.2.2 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織差異基因表達譜構(gòu)成的散點圖 見圖3。

2.2.3 GO分析 使用DAVID對CSA模型組與正常組大鼠垂體組織比較獲得的差異基因進行GO分析，結(jié)果顯示，1 181個GOs被上調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)，其中包括GO BP(biological process)944條、GO CC(cellular componen)111條、GO MF(molecular function)126條。在此分析中，主要針對GO BP進行分析，并且P值越小，該條GO Term越有意義，其中與調(diào)節(jié)CSA有相關(guān)聯(lián)系的GO Term主要包括對細胞間信號傳導活性的調(diào)節(jié)、G蛋白偶聯(lián)受體信號調(diào)節(jié)、神經(jīng)細胞功能的調(diào)節(jié)、對外界刺激的應激反應、凝血功能的調(diào)節(jié)、血管形成、酶活性的調(diào)節(jié)等；113個GOs被下調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)，其中包括GO BP 49條、GO CC 37條、GO MF 27條。其中較為有意義的GO Term主要包括對細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞對藥物的反應、調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)、糖皮質(zhì)激素刺激、離子通道活性的調(diào)節(jié)、運動行為的調(diào)節(jié)等。圖4和表2為最有意義的部分差異基因所參與的GO功能及注釋。

表1 評估RNA量和RNA質(zhì)量

Tab.1 Assessment of RNA quantity and RNA quality

序號樣品編號A260/280A260/230質(zhì)量濃度(μg/μL)總量(μg)樣品質(zhì)量描述3C51.900.980.1153.9RNA基本完好6C61.871.160.2468.8RNA基本完好9C71.981.270.2127.5RNA基本完好12C81.961.780.2127.5RNA基本完好15Z51.980.830.29410.5RNA基本完好18Z61.960.530.2388.5RNA基本完好21Z71.981.140.2398.5RNA基本完好24Z81.910.960.5155.2RNA基本完好

Z為正常組垂體組織； C為模型組垂體組織。

圖1 變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA樣本的完整性

Fig.1 Detection of RNA sample integrity by denaturing agarose gel electrophoresis

數(shù)字代表樣品編號，M泳道Hela Cell Control RNA。

圖2 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織聚類分析熱圖

Fig.2 Clustering analysis thermogram of pituitary tissue of rats in the CSA model and the normal group

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；黑色：無差異基因。

圖3 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織差異基因表達譜構(gòu)成的散點圖

Fig.3 Scatter plot of the gene expression profile of the pituitary tissue in the CSA model group and the normal group

2.2.4 信號通路分析 將CSA模型組與正常組大鼠垂體組織比較所得到的差異基因進行信號通路分析，結(jié)果顯示，上調(diào)的差異基因共調(diào)控96條信號通路(圖5A)，主要涉及神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、脂肪細胞因子信號通路、TGF-β信號通路、AMPK信號通路、PPAR信號通路、p53信號通路、ECM受體相互作用等。下調(diào)的差異基因共調(diào)控48條信號通路(圖5B)，

圖4 模型組與正常組垂體組織差異基因所調(diào)控的部分GOs

Fig.4 Part of GOs regulated by pituitary tissue differential genes in the model group and the normal group

A：上調(diào)的差異基因所調(diào)控的部分GOs；B：下調(diào)的差異基因所調(diào)控的部分GOs。

表2 差異基因GO功能注釋結(jié)果

Tab.2 GO function annotation results of the differential genes

差異基因GOTermGO名稱基因數(shù)P值GO過程中部分基因名稱上調(diào)GO:0004871細胞間信號傳導活性的調(diào)節(jié)170.007581Hdgfl1、Rgs18、Igbp1bGO:0007186G蛋白偶聯(lián)受體信號調(diào)節(jié)150.002007Olr1330、Irx5GO:0042551神經(jīng)細胞功能的調(diào)節(jié)110.006243Foxb1、Irx3GO:0006950對外界刺激的應激反應110.008009Nr4a2、Dpep3GO:0007596凝血功能的調(diào)節(jié)90.010686F2rl2、PdiltGO:0001569血管形成70.001258Pitx2、Cd36GO:0008233酶活性的調(diào)節(jié)50.017034RGD1308751下調(diào)GO:0007049調(diào)節(jié)細胞周期120.019939Ist1、Obfc1、Wdr12GO:0035690細胞對藥物的反應70.011801Tlr3、Med17GO:0012505調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)50.011539Trpc2、Grm1GO:0031960糖皮質(zhì)激素刺激50.011464Gnrh1GO:0005216離子通道活性的調(diào)節(jié)40.000082Kcnd3、Hils1GO:0007626調(diào)節(jié)運動行為30.009132Apba2

圖5 垂體組織組間比較所得到的差異基因所調(diào)控的信號通路

Fig.5 Pituitary tissue was compared with the resulting differential gene regulated by the signaling pathway

A：上調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)的信號通路；B：下調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)的信號通路。

為Toll樣受體信號通路、凝血酶受體信號通路、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、Wnt信號通路、甲狀腺激素信號通路、RAL/RAN/ARF信號通路等。表3為部分差異基因所調(diào)控的信號通路及注釋。

表3 差異基因KEGG通路注釋

Tab.3 Annotation of differential gene KEGG pathway

差異基因信號通路P值基因數(shù)通路中部分基因名稱上調(diào)神經(jīng)活性的配體-受體相互作用0.01191122F2rl2脂肪細胞因子信號通路0.00303117Cd36、Nr4a2TGF-β信號通路0.00337216Pitx2、Hils1AMPK信號通路0.00520813Cd、Serpinb10PPAR信號通路0.00732911Cd36、Kcnd3p53信號通路0.0026899Rprm、RprmECM受體相互作用0.0031595Cd3下調(diào)Toll樣受體信號通路0.00375611Tlr3凝血酶受體信號通路0.0144757F2rlG蛋白偶聯(lián)受體信號通路0.0050747Rgs18、EbfWnt信號通路0.0014786Gnrh、Pitx2甲狀腺激素信號通路0.0047385Med17RAL/RAN/ARF信號通路0.0003693Rgs18

3 討 論

NEI網(wǎng)絡在CSA發(fā)病過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，存在于NEI系統(tǒng)中的細胞因子、神經(jīng)肽、細胞信息物質(zhì)、激素等通過神經(jīng)、免疫或者體液調(diào)節(jié)以維持機體的穩(wěn)定性[7]。HPA軸是NEI網(wǎng)絡的重要組成部分，與CSA的發(fā)病密切相關(guān)，當椎動脈局部受到刺激時，椎-基底動脈血管屈曲、扭轉(zhuǎn)而發(fā)生痙攣，損傷血管內(nèi)皮，產(chǎn)生無菌性炎癥刺激，此時大腦通過復雜的神經(jīng)通路接受機體應激信號而激活HPA軸，機體的生理狀態(tài)發(fā)生改變。椎-基底動脈系統(tǒng)受刺激的同時具有與HPA軸相似的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，通過基因調(diào)控組成特異性的、功能協(xié)調(diào)的反饋調(diào)節(jié)回路[8]。

為了進一步探討CSA發(fā)病的分子機制，本研究采用全基因芯片技術(shù)，分析垂體差異基因表達譜，進而分析垂體在CSA發(fā)病過程中的調(diào)控作用，從生物信息學角度對其機制進一步闡釋。模型組和正常組垂體組織差異基因表達譜分析結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，共有321個差異基因的表達，其中表達上調(diào)的有203個，表達下調(diào)的共有118個(|fold change︱>2，OR方法修正后的P<0.05)，差異基因所調(diào)控的GO Term主要有對細胞間信號轉(zhuǎn)導活性的調(diào)節(jié)、神經(jīng)細胞功能的調(diào)節(jié)、對外界刺激的應激反應、凝血功能的調(diào)節(jié)、血管形成的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)、調(diào)節(jié)細胞周期等；參與的信號通路主要有脂肪細胞因子信號通路、TGF-β信號通路、AMPK信號通路、PPAR信號通路、凝血酶受體信號通路、Wnt信號通路、RAL/RAN/ARF信號通路等。

CSA的發(fā)病是機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)共同的作用結(jié)果，其基本病理改變是椎-基底動脈供血功能異常和動脈血管結(jié)構(gòu)改變，管壁通透性增加，血管舒張功能變化等。LI等[9]報道變異的Fdgfl1基因能降低極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、載脂蛋白C水平，與血清高含量高密度脂蛋白引起的頸部動脈斑塊疾病相關(guān)，還與缺血性心臟疾病引起的心臟血管功能改變相關(guān)。分布在椎動脈及周圍組織的交感神經(jīng)，由于長期遭受血管形態(tài)改變或局部無菌炎性刺激時，交感神經(jīng)通過復雜的神經(jīng)通路向大腦傳遞應激信號而激活HPA軸。本研究中垂體組織神經(jīng)功能相關(guān)的上調(diào)基因有Foxb1和Irx3等，BILELLA等[10]研究表明，F(xiàn)oxb1基因的表達參與機體的多種生理病理過程，其中包括參與調(diào)節(jié)交感神經(jīng)的功能而進一步調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，垂體高表達的Foxb1基因在CSA疾病過程中與椎-基底動脈痙攣有關(guān)，F(xiàn)oxb1也與炎性刺激[11]、神經(jīng)免疫相關(guān)[12]，可參與疾病的免疫反應；SCARLETT等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮生長因子的刺激下，Irx3通過Notch信號通路介導在人類微血管內(nèi)皮細胞(VEGF)中高表達，在創(chuàng)傷愈合的過程中Irx3能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的遷移、趨化和浸潤，致新血管形成，CSA中椎-基底動脈的舒縮功能改變與Irx3調(diào)控的血管內(nèi)皮細胞的遷移、血管重構(gòu)有關(guān)。CSA患者血液較正常人粘稠度增高[14]。本研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)凝血功能的F2rl2、Pdilt等基因上調(diào)，這與CSA患者血液高凝狀態(tài)有關(guān)，血液相對呈高凝狀態(tài)，使已受損的血管內(nèi)膜更易附著粘附因子，使椎-基底動脈舒縮功能障礙加重；而調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)的基因Trpc2和Grm1在垂體組織中表達下調(diào)，這與椎-基底動脈內(nèi)膜活性下降有關(guān)。

垂體組織中上調(diào)的差異基因信號通路有脂肪細胞因子信號通路。脂肪細胞因子是一類具有血管活性，并在維持血管系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫應答過程中發(fā)揮重要作用的激素和細胞因子[15]，脂肪細胞因子信號通路的激活能夠抑制生長因子引起動脈平滑肌細胞的增殖及遷移。TGF-β信號通路激活使成纖維細胞增加ECM的合成與分泌[16]，CSA患者由于椎動脈及其周圍組織遭受長期慢性、反復損傷，引起TGF-β1持續(xù)合成釋放及自我誘生，而使ECM沉積在椎動脈及周圍組織，形成組織纖維化和瘢痕。AMPK信號通路激活不僅能促進血管內(nèi)皮細胞生成[17]，而且能導致頸椎周圍的骨骼肌功能異常[18]。PPAR信號通路激活可導致血管內(nèi)皮細胞損傷、血管平滑肌細胞及單核/巨噬細胞等增殖遷移，導致早期血管壁硬化[19]。Toll樣受體信號通路下調(diào)，使炎癥反應刺激細胞產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素的合成而激活HPA軸，這在免疫應答的調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，垂體細胞感應這種信號釋放促炎性細胞因子IL-6、LIF，形成負反饋糖皮質(zhì)激素回路。Wnt信號通路能促進血管的新生，但在本研究中表達下調(diào)，這可能與多種激活的信號通路相拮抗有關(guān)。

本研究成功復制CSA大鼠模型后，應用基因芯片技術(shù)，分析了模型組和正常組大鼠垂體組織基因表達譜特征，得出大鼠垂體對CSA的主要調(diào)節(jié)作用，研究方法較新穎，對闡明CSA發(fā)病機制和進一步實驗研究及臨床實際具有一定的指導意義。結(jié)果表明，CSA的發(fā)病作用機制是多基因、多信號通路、多功能的綜合方式進行調(diào)節(jié)的結(jié)果，垂體的調(diào)控機制主要通過對炎性刺激、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)椎動脈功能及內(nèi)膜系統(tǒng)而實現(xiàn)，這為進一步研究CSA的防治提供了線索。但是，垂體對CSA的調(diào)控乃至HPA軸甚至是整個NEI網(wǎng)絡調(diào)控的具體機制仍需要進一步研究。中醫(yī)藥治療CSA有明顯的優(yōu)勢。本課題組下一步將進行中醫(yī)藥干預并應用基因芯片技術(shù)，尋找中醫(yī)藥治療CSA具有重要意義的調(diào)控靶點，為臨床治療提供有效的科學依據(jù)。

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