鄧楠琳，朱 芮，李敏超

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、哮喘等慢性氣道炎癥性疾病，由于氣道阻塞、黏液分泌增加和氣體交換障礙等原因?qū)е職獾纼?nèi)處于低氧狀態(tài)[1]。研究表明，低氧能誘導(dǎo)哮喘發(fā)作、炎癥浸潤及組織結(jié)構(gòu)重塑[2-3]。氣道重塑作為慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征，期間有大量的細胞因子及生長因子參與并發(fā)揮作用。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases 9, MMP-9)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta1, TGF-β1)涉及上皮下纖維化、上皮轉(zhuǎn)化及氣道平滑肌增殖等，是氣道重塑重要的細胞因子[4-5]。此外，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是低氧下重要的轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)大量目的基因激活并引起炎癥浸潤、血管重塑、細胞增殖遷移等[6-7]。另有研究表明表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是氣道上皮重要的表面受體，感受著各種外界刺激，能激活胞內(nèi)多種信號，可誘導(dǎo)HIF-1α激活[8-9]，同時異?；罨腅GFR能夠促進氣道平滑肌增殖，參與上皮損傷修復(fù)，是氣道重塑的重要途徑[10-11]?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本研究旨在證實低氧刺激對人氣道上皮細胞氣道重塑相關(guān)因子MMP-9和TGF-β1的影響，以及低氧是否能通過EGFR誘導(dǎo)HIF-1α表達而引起氣道重塑相關(guān)因子表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人支氣管上皮細胞(16HBE)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；兔抗人MMP-9單克隆抗體購自英國Abcam公司；小鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自美國Novus公司；兔抗人TGF-β1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人β-actin單克隆抗體購自南京巴傲得生物科技有限公司；山羊抗兔、抗小鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-購自上海東洋紡生物科技公司；HIF-1α抑制劑YC-1、EGFR抑制劑AG1478購自美國Selleck公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 16HBE細胞貼壁生長于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細胞匯合達70%時，更換新鮮無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，將細胞分組進行相關(guān)實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期16HBE細胞，2.5 g/L胰酶消化，血清終止細胞消化，800 r/min離心5 min，細胞計數(shù)后，以1×104/mL的密度接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，置入37 ℃、50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)。待細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基再維持24 h，置入37 ℃、20 mL/L O2、50 mL/L CO2、930 mL/L N2的三氣培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，至6、12、24、48 h時，吸棄上清，每孔加入100 μL培養(yǎng)基及10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h，于酶標儀上450 nm處檢測吸光度值A(chǔ)。細胞存活率(%)=[(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)]×100%。每組5個復(fù)孔。

1.4 實驗分組 對照組細胞置于37 ℃、50 mL/L CO2、950 mL/L空氣的CO2細胞培養(yǎng)箱。低氧組細胞置于37 ℃、20 mL/L O2、50 mL/L CO2、930 mL/L N2的三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)，各亞組細胞分別培養(yǎng)6、12、24 h。從中選擇MMP-9和TGF-β1表達較高的時間組，予以EGFR抑制劑AG1478和HIF-1α抑制劑Lificiguat(YC-1)干預(yù)，或選擇HIF-1α蛋白相對表達量較高的時間組予以EGFR抑制劑AG1478，分別作為低氧+YC-1組和低氧+AG1478組，在低氧刺激前分別予以10 μmol/L YC-1、10 μmol/L AG1478干預(yù)處理，將細胞快速移至37 ℃、20 mL/L O2、50 mL/L CO2、930 mL/L N2的三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)至設(shè)定時間。

1.5 Western blot測定HIF-1α、MMP-9和TGF-β1蛋白的表達 各組細胞培養(yǎng)至設(shè)定時間，加入細胞裂解液于冰上吹打裂解20 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)電泳后恒流250 mA轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜。室溫50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人MMP-9單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1∶300)、小鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶500)及內(nèi)參兔抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 400)4 ℃孵育過夜；洗膜后，山羊抗兔或小鼠IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h。充分洗膜后ECL顯影，應(yīng)用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin灰度比值表示蛋白相對表達量。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測MMP-9和TGF-β1mRNA的表達 各組細胞培養(yǎng)至設(shè)定時間，按Trizol試劑說明書分別提取各組細胞總RNA，按高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Rever-TraAce-α-逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TGF-β1的上、下游引物：5′-GCAACAATTCCTGGCGATAC-3′，5′-CTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3′；MMP-9的上、下游引物：5′-GTACCACGGCCAACTACGAC-3′，5′-GCCTTGGAAGATGAATGGAA-3′；β-actin的上、下游引物：5′-CCTGTACGC-

CAACACAGTGC-3′，5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct相對定量表示各組TGF-β1和MMP-9 mRNA的表達量。

2 結(jié) 果

2.1 細胞存活率檢測結(jié)果 CCK-8檢測結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)6、12、24 h各組細胞存活率分別為(96.2±2.1)%、(85.3±2.3)%和(78.5±1.6)%，與對照組(100±2.6)%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，培養(yǎng)時間延長至48 h時的存活率為(58.6±1.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04)。表明短時間低氧培養(yǎng)對細胞存活率無明顯影響，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞貼壁能力逐漸下降，細胞存活率降低(圖1)。

2.2 低氧對MMP-9和TGF-β1表達的影響 實時熒光定量PCR檢測各組16HBE細胞內(nèi)MMP-9和TGF-β1mRNA表達變化，隨著低氧培養(yǎng)時間的延長，細胞內(nèi)MMP-9和TGF-β1轉(zhuǎn)錄量逐漸增加，6、12、24 h胞內(nèi)TGF-β1mRNA相對表達量分別為1.57±0.18、2.30±0.17、3.62±0.26，較對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。6、12、24 h的MMP-9 mRNA相對表達量分別為1.89±0.21、5.22±0.41、7.91±0.10，較對照組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。Western blot檢測結(jié)果顯示，隨著低氧培養(yǎng)時間的延長，MMP-9和TGF-β1蛋白表達逐漸升高，6、12、24 h的TGF-β1蛋白相對表達量分別為0.70±0.05、0.78±0.04、1.10±0.08，與對照組(0.58±0.03)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。6、12、24 h的MMP-9蛋白相對表達量分別為1.03±0.04、1.14±0.06、1.52±0.07，與對照組(0.55±0.02)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。提示低氧能誘導(dǎo)16HBE細胞內(nèi)MMP-9和TGF-β1表達上調(diào)。

圖1 低氧培養(yǎng)不同時間點的16HBE細胞存活率

Fig.1 The survival rate of 16HBE cells treated with hypoxia at different time points

與對照組(0 h組)比較，*P=0.004。

圖2 低氧處理不同時間對16HBE細胞MMP-9和TGF-β1蛋白及mRNA表達的影響

Fig.2 Effects of different hypoxia treatment duration on the protein and mRNA expressions of MMP-9 and TGF-β1in 16HBE cells

A：MMP-9和TGF-β1蛋白相對表達變化；B：MMP-9和TGF-β1mRNA相對表達變化。與對照組(0 h組)比較，*P<0.05。

2.3 EGFR及HIF-1α的抑制劑對TGF-β1和MMP-9表達的影響 基于前述研究結(jié)果，細胞MMP-9和TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均于24 h時增幅最大，選擇24 h為干預(yù)培養(yǎng)時間。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，低氧+YC-1組、低氧+AG1478組胞內(nèi)TGF-β1mRNA相對表達量分別為2.88±0.38、3.22±0.43，與低氧組(5.04±0.85)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。低氧+YC-1組、低氧+AG1478組的MMP-9 mRNA相對表達量分別為2.42±1.32、4.93±0.54，與低氧組(13.43±5.06)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。Western blot檢測結(jié)果顯示，低氧+YC-1組、低氧+AG1478組的TGF-β1蛋白水平分別為0.82±0.03、0.94±0.03，與低氧組(1.08±0.03)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。低氧+YC-1組、低氧+AG1478組的MMP-9蛋白水平分別為0.92±0.02、0.94±0.03，與低氧組(1.32±0.04)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。提示AG1478、YC-1能抑制低氧培養(yǎng)16HBE細胞的MMP-9和TGF-β1表達。

圖3 不同處理對16HBE細胞MMP-9和TGF-β1蛋白及mRNA表達的影響

Fig.3 Effects of different treatment on the protein and mRNA expressions of MMP-9 and TGF-β1in 16HBE cells

A：MMP-9和TGF-β1蛋白表達情況；B：MMP-9和TGF-β1mRNA表達情況。與對照組比較，#P<0.01；與低氧組比較，*P<0.01。

2.4 低氧及EGFR抑制劑AG1478對HIF-1α蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組僅可見少量HIF-1α蛋白表達，低氧培養(yǎng)6、12、24 h細胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達量明顯增高，相對表達量分別為1.16±0.05、0.98±0.06、0.64±0.04，與對照組(0.47±0.02)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。提示低氧能誘導(dǎo)16HBE細胞內(nèi)HIF-1α表達上調(diào)。

基于前述研究結(jié)果顯示的HIF-1α蛋白相對表達量于6 h時增幅最大，選擇6 h為EGFR抑制劑AG1478干預(yù)培養(yǎng)時間。Western blot檢測結(jié)果顯示，低氧+AG1478組中HIF-1α蛋白相對表達量為0.93±0.04，低于低氧組(1.20±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，圖5)。提示AG1478能減弱低氧下高表達的HIF-α。

3 討 論

氣道重塑是COPD和哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的重要病理生理特征，是疾病慢性化的主要原因，涉及了氣道上皮損傷、上皮下纖維化、氣道平滑肌增殖等過程。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，其主要功能是維持降解和重塑細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，同時還能介導(dǎo)炎癥細胞的聚集和破壞細胞結(jié)構(gòu)，參與氣道重塑和炎癥反應(yīng)。TGF-β1是一種促纖維化因子，通過促進氣道平滑肌細胞增殖遷移，成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)合成，引起氣道重塑，二者與氣道重塑的發(fā)生發(fā)展都有著密切關(guān)系[4-5]。

圖4 低氧處理不同時間對16HBE細胞HIF-1α蛋白表達的影響

Fig.4 Effects of different hypoxiatreatment duration on the protein expression of HIF-1α in 16HBE cells

與對照組(0 h組)比較，*P<0.01。

圖5 低氧及EGFR抑制劑AG1478對16HBE細胞HIF-1α蛋白表達的影響

Fig.5 Effects of hypoxia and EGFR inhibitor AG1478 on the protein expression of HIF-1α in 16HBE cells

與對照組比較，#P=0.000；與低氧組比較，*P=0.000。

同時，COPD和哮喘等慢性氣道炎癥性疾病時，由于氣道阻塞、黏液分泌增加和氣體交換障礙等原因?qū)е職獾纼?nèi)處于低氧狀態(tài)[2]，而長期慢性低氧刺激可造成炎癥、組織結(jié)構(gòu)重塑及肺組織細胞凋亡[12-13]。在肝纖維化的相關(guān)研究、心肌細胞炎癥浸潤研究中均指出低氧在調(diào)控MMP、TGF等細胞因子的表達中有著重要作用[14-15]。本實驗利用三氣培養(yǎng)箱，模擬氣道低氧環(huán)境培養(yǎng)人支氣管上皮細胞16HBE，結(jié)果顯示MMP-9和TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均出現(xiàn)上調(diào)，證實了低氧能刺激人支氣管上皮細胞16HBE中氣道重塑相關(guān)因子MMP-9和TGF-β1的表達。

HIF-1α作為低氧下重要的轉(zhuǎn)錄因子，是低氧下大量目的基因激活的強力催化劑，低氧通過增加HIF-1α的穩(wěn)定性，促進其與低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element, HRE)的結(jié)合，誘導(dǎo)大量目的基因激活，如TGF、MMP、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)等[6]，從而引起炎癥反應(yīng)、血管重塑、細胞增殖遷移等。EGFR屬于表皮生長因子受體家族，是胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性的一類跨膜受體[16]，廣泛分布于上皮組織中，調(diào)節(jié)上皮細胞的增殖、遷移及分化等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，異?；罨?EGFR與氣道重塑密切相關(guān)，能夠促進氣道血管生成，成纖維細胞/肌纖維母細胞活化增殖，參與上皮損傷修復(fù)等[17-18]。XU等[19]的研究指出EGFR通過HIF-1α途徑介導(dǎo)增強小細胞肺癌侵襲性。LI等[20]在高糖所致腎小球系膜細胞纖維化研究中指出EGFR通過HIF-1α途徑增強該效應(yīng)，提示EGFR/HIF-1α信號通路在細胞侵襲、組織修復(fù)與重構(gòu)中有重要意義。本實驗運用EGFR特異性抑制劑AG1478、HIF-1α抑制劑YC-1干預(yù)低氧環(huán)境中的16HBE細胞，二者可使由低氧誘導(dǎo)的MMP-9和TGF-β1的高水平表達明顯抑制，同時AG1478能使低氧誘導(dǎo)高水平表達的HIF-1α得到抑制。本實驗研究結(jié)果初步證實了低氧誘導(dǎo)HBE細胞氣道重塑相關(guān)因子的產(chǎn)生可能與EGFR、HIF-1α參與的信號通路有關(guān)。

本研究探討了低氧刺激對氣道上皮細胞氣道重塑相關(guān)分子影響及其相關(guān)信號機制，結(jié)果提示低氧刺激可能通過EGFR誘導(dǎo)HIF-1α表達而促進氣道重塑相關(guān)因子MMP-9和TGF-β1表達，最終導(dǎo)致氣道重塑。這將有助于尋找新的作用靶點以減輕氣道重塑，為治療慢性氣道炎癥性疾病提供了新的實驗依據(jù)，同時為下一步更深入全面研究該信號通路提供了方向。

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