張靖垚，畢建斌，劉蘇順，龐 青，劉 昌

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1. 肝膽外科；2. 外科ICU，陜西西安 710061)

膿毒癥(sepsis)常常繼發(fā)于燒傷、外傷、手術(shù)創(chuàng)傷、休克及感染等臨床情況，早期得不到及時(shí)妥善處理，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)甚至死亡[1]。腸道是大多腹腔感染所致膿毒癥的始動(dòng)器官，腸壁的缺血、缺氧及再灌注損傷，可以導(dǎo)致腸道屏障的破壞，進(jìn)而引起腸道菌群移位及內(nèi)毒素?cái)U(kuò)散，通過血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、直接擴(kuò)散等途徑引起菌血癥，最終導(dǎo)致全身感染[2-3]。肺臟因其特殊解剖結(jié)構(gòu)，毛細(xì)血管網(wǎng)豐富，成為膿毒癥最易受損的器官，早期即可出現(xiàn)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)[4]。近年來隨著科技的發(fā)展及醫(yī)療進(jìn)步，對(duì)于膿毒癥的認(rèn)識(shí)越來越深入，但是針對(duì)膿毒癥的治療尚未取得突破性進(jìn)展，因此尋找新的或者輔助的臨床治療手段非常重要。已有研究表明，腸淋巴途徑在MODS中發(fā)揮重要作用，阻斷休克時(shí)腸淋巴液回流可減輕大鼠肺、心、腎、肝等重要器官的炎癥反應(yīng)及器官損傷程度[5]；也有研究發(fā)現(xiàn)，腸系膜淋巴管結(jié)扎(mesenteric lymph duct ligation, MLDL)可以減輕休克大鼠的肝損傷[6]；最新的研究也表明其對(duì)熱射病所致的肺損傷有保護(hù)作用[7]。但是MLDL在膿毒癥所致的器官損傷中的作用尚未見報(bào)道。本研究即重點(diǎn)探討MLDL后阻斷腸淋巴液回流對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)所致大鼠膿毒癥的肺臟及腸道損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)Sprague Dawley雄性大鼠45只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量220～260 g。本研究將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham組，n=15)、膿毒癥組(CLP組，n=15)和MLDL組(CLP+MLDL組，n=15)。各組大鼠于CLP造模24 h后再次使用戊巴比妥鈉全身麻醉，開腹游離腹主動(dòng)脈并采集動(dòng)脈血進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)；同時(shí)收集距離回盲部約10 cm處的近端回腸組織及肺臟組織，行相應(yīng)的病理及生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 模型制備及干預(yù)

1.2.1 膿毒癥大鼠模型的制備 采用CLP法建立膿毒癥大鼠模型[8]：腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉大鼠后，沿腹部正中線切3 cm長(zhǎng)切口，開腹、暴露盲腸，在距盲腸根部1/2處結(jié)扎盲腸，用21G針頭穿刺盲腸1次，擠出少量腸內(nèi)容物，還納盲腸并縫合切口。Sham組只開腹進(jìn)行盲腸探查、不結(jié)扎穿孔，術(shù)后給予大鼠皮下注射生理鹽水30 mL/kg 補(bǔ)液；MLDL組于CLP造模時(shí)行MLDL操作；CLP組于CLP造模時(shí)暴露腸系膜淋巴管(mesenteric lymph duct, MLD)，未予結(jié)扎，術(shù)后給予等量液體補(bǔ)液。

1.2.2 MLDL處理 腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠后，沿腹部正中線切3 cm長(zhǎng)切口，打開腹腔，輕輕推開腸管，暴露腸系膜根部，游離腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery, SMA)，仔細(xì)分離與SMA相伴行的MLD，在MLD下穿線結(jié)扎[9]。

1.3 肺泡灌洗液的收集 根據(jù)劉彥[10]的報(bào)道采用在體全肺肺灌洗法收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。將7號(hào)塑料輸液管的針頭端剪掉，留出約3 cm長(zhǎng)的一段輸液管，將該段輸液管的一端套在5 mL注射器上，暴露大鼠氣管，在氣管上剪一小切口，將輸液管插入氣管腔內(nèi)，并用縫線固定。將2 mL、37 ℃無菌生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，間隔30 s后，將其抽回，如此進(jìn)行3次，共收集到BALF約5 mL，1 500 r/min、4 ℃離心10 min，將離心沉淀的細(xì)胞團(tuán)用0.3 mL生理鹽水懸浮，制成細(xì)胞懸液。

1.4 動(dòng)脈血?dú)夥治?將收集的動(dòng)脈血采用ALB5型全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)。

1.5 肺臟及腸道組織的HE染色 將部分切取的肺臟及回腸組織，用40 g/L中性甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.6 急性肺損傷(ALI)評(píng)分及腸道Chiu’s評(píng)分 根據(jù)FALLER等[11]的方法評(píng)估大鼠的ALI評(píng)分及CHIU等[12]的方法評(píng)估大鼠的腸道損傷。

1.7 BALF中炎癥因子、細(xì)胞及總蛋白水平的檢測(cè) 根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書指示，測(cè)定BALF中TNF-α、IL-6及總蛋白的含量；用Neubauer Chamber

方法測(cè)定BALF中細(xì)胞總數(shù)及分類[13]。

1.8 血液D-乳酸的檢測(cè) 根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書指示，測(cè)定血液中D-乳酸含量。

1.9 腸道組織二胺氧化酶(DAO)的檢測(cè) 根據(jù)南京建成購買的生化試劑盒說明書指示，檢測(cè)腸道組織DAO的含量。

1.10 細(xì)菌負(fù)荷實(shí)驗(yàn) 取血液組織(1 mL)、肺臟(1 g) 及回腸組織(1 g)稱重切碎后再勻漿，加9 g/L生理鹽水連續(xù)稀釋成不同倍數(shù)的稀釋液，取各種不同倍數(shù)的稀釋液分別定量滴入血瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，采用平板活菌計(jì)數(shù)法讀出菌落數(shù)，并根據(jù)組織重量和稀釋倍數(shù)計(jì)算出每毫升組織懸液中的細(xì)菌數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 MLDL減輕膿毒癥大鼠的肺損傷 CLP造模后的膿毒癥大鼠可表現(xiàn)出不同程度的精神差、毛發(fā)濕冷倒立、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少以及脫水等臨床表現(xiàn)。在大鼠麻醉恢復(fù)后，經(jīng)過MLDL處理的大鼠可更快地從膿毒癥打擊中恢復(fù)，其活動(dòng)能力明顯強(qiáng)于CLP組大鼠。大鼠肺臟組織的HE染色可見，CLP組大鼠肺組織內(nèi)可見大量肺泡組織破裂、結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺實(shí)變嚴(yán)重；MLDL組大鼠肺組織內(nèi)則可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，散在的肺泡壁充血、增厚，但肺實(shí)變明顯減輕，肺泡組織結(jié)構(gòu)較完整(圖1A)。血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，MLDL可明顯改善膿毒癥大鼠的氧合狀況，提升PaO2(圖1B)；通過統(tǒng)計(jì)各組大鼠的肺臟濕/干比，提示MLDL可以減輕膿毒癥時(shí)肺水腫、出血及充血情況(圖1C)。綜合各組大鼠臨床及病理學(xué)特點(diǎn)，計(jì)算ALI評(píng)分，發(fā)現(xiàn)MLDL可以明顯降低膿毒癥大鼠的肺損傷評(píng)分(圖1D)。

圖1 MLDL對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷的影響

Fig.1 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) alleviated sepsis-induced lung injury in rats

A：大鼠肺臟組織的HE染色；B：PaO2水平；C：肺臟濕/干比；D：ALI評(píng)分。Sham：假手術(shù)對(duì)照組，CLP：膿毒癥組，CLP+MLDL：MLDL處理組。與CLP組比較，*P<0.05。

2.2 MLDL降低膿毒癥大鼠BALF中炎癥因子、蛋白及細(xì)胞外溢水平 CLP造模24 h后收集各組大鼠的BALF，首先通過ELISA方法檢測(cè)了炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，評(píng)估肺部局部炎癥水平。結(jié)果顯示，MLDL可以明顯減少BALF中TNF-α和IL-6的水平(圖2A、2B)。檢測(cè)灌洗液中細(xì)胞及蛋白的水平，以評(píng)估肺泡的滲出情況，結(jié)果顯示，MLDL可以明顯減少BALF中細(xì)胞總數(shù)及總蛋白水平(圖2C、2D)。

2.3 MLDL對(duì)膿毒癥大鼠腸道無明顯保護(hù)作用 大鼠處死后取距離回盲部約10 cm處的回腸組織行HE染色，結(jié)果顯示，CLP組大鼠小腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞明顯，炎性細(xì)胞大量聚集在黏膜及黏膜下層，而MLDL處理組大鼠的小腸組織病理與CLP組未見明顯異常(圖3A)。通過計(jì)算大鼠Chiu’s評(píng)分(圖3B)，檢測(cè)血液D-乳酸(圖3C)及腸道組織DAO的水平(圖3D)，結(jié)果表明MLDL對(duì)膿毒癥大鼠的腸道損傷無明顯保護(hù)作用。

圖2 MLDL對(duì)膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中的炎癥因子(A、B)、細(xì)胞總數(shù)(C)及蛋白水平(D)的影響

Fig.2 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) decreased bronchoalveolar lavage fluid (BALF) inflammatory cytokines, total cells and protein levels in septic rats

Sham：假手術(shù)對(duì)照組，CLP：膿毒癥組，CLP+MLDL：MLDL處理組。與CLP組比較，*P<0.05，#P<0.01。

圖3 MLDL對(duì)膿毒癥腸道損傷的影響

Fig.3 Mesenteric lymph duct ligation (MLDL) had no effect on sepsis-induced intestinal injury in rats

A：回腸組織的HE染色結(jié)果；B：Chiu’s評(píng)分；C：D-乳酸水平；D：DAO水平的影響。Sham為假手術(shù)對(duì)照組，CLP為膿毒癥組，CLP+MLDL為MLDL處理組。

2.4 MLDL降低膿毒癥大鼠血液及肺臟組織的細(xì)菌負(fù)荷，但對(duì)腸道中的細(xì)菌水平無明顯影響 CLP造模24 h后收集各組大鼠的血液、肺臟及腸道標(biāo)本，制成10%的勻漿后檢測(cè)上述3種組織中的細(xì)菌負(fù)荷水平。結(jié)果顯示，MLDL可以明顯降低膿毒癥大鼠血液及肺臟組織中的細(xì)菌負(fù)荷水平，但是對(duì)大鼠腸道組織的細(xì)菌水平則無明顯影響，甚至有加重細(xì)菌負(fù)荷趨勢(shì)(圖4)。

圖4 MLDL對(duì)膿毒癥大鼠血液、肺臟及腸道組織細(xì)菌負(fù)荷的影響

Fig.4 Effect of mesenteric lymph duct ligation (MLDL) on bacterial load of the blood, lung and intestines

CLP為膿毒癥組，CLP+MLDL為MLDL處理組，血液(blood)、肺臟(lung)及腸道(intestine)。*P<0.01。

3 討 論

膿毒癥是感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)所致的致命性器官功能障礙，是感染誘發(fā)的全身機(jī)體生理、病理及功能的異常綜合表現(xiàn)，全球每年約有數(shù)百萬人患膿毒癥，近年來越來越受到臨床醫(yī)生及科學(xué)家的關(guān)注[1,14]。膿毒癥時(shí)致病因子可激活炎癥細(xì)胞產(chǎn)生、表達(dá)和過度釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，啟動(dòng)炎癥瀑布連鎖反應(yīng)，通過激活中性粒細(xì)胞、損傷內(nèi)皮細(xì)胞，釋放氧自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物及溶酶體酶，引起機(jī)體微循環(huán)障礙、凝血機(jī)制紊亂及細(xì)胞凋亡等機(jī)體病理變化[15]。腹腔感染所致膿毒癥時(shí)，由于腸屏障功能損傷、腸源性內(nèi)毒素血癥和腸道細(xì)菌移位，可引起遠(yuǎn)隔器官如肺臟、肝臟、心臟等的功能損害。腸道屏障功能障礙致腸道內(nèi)細(xì)菌/內(nèi)毒素移位(bacteria/endotoxin translocation, BET)所引起的腸源性感染，是膿毒癥發(fā)展為MODS的始動(dòng)環(huán)節(jié)[16-17]。

隨著學(xué)者們對(duì)腸源性BET的腸淋巴途徑研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)腸淋巴液回流在膿毒癥進(jìn)展中的重要作用，深入揭示其作用機(jī)制成為危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[18]。腹膜組織存在豐富的毛細(xì)淋巴管網(wǎng)，臟層腹膜，尤其是消化管表面的毛細(xì)淋巴管和淋巴管網(wǎng)共同形成淋巴管叢，發(fā)出集合淋巴管注入局部淋巴結(jié)，MLD是一個(gè)主要的流出通道。在膿毒癥情況下，腹腔內(nèi)臟器所吸收的有害物質(zhì)及細(xì)菌也會(huì)通過MLD轉(zhuǎn)運(yùn)。研究證實(shí)，腹膜的毛細(xì)淋巴管對(duì)一些大分子物質(zhì)具有一定的吸收作用[19]。本研究表明，膿毒癥大鼠的肺損傷(肺臟病理、PaO2，肺臟濕/干比、肺泡灌洗液中的炎癥因子、細(xì)胞及蛋白外溢)顯著重于Sham組，但MLDL組大鼠的上述指標(biāo)均顯著輕于CLP組，提示MLDL使淋巴液斷流，可以減少甚至抑制腹腔內(nèi)的細(xì)菌及內(nèi)毒素進(jìn)入淋巴循環(huán)，對(duì)肺臟功能具有一定的保護(hù)作用。

同時(shí)，腸道是腹腔感染所致膿毒癥時(shí)TNF-α的重要細(xì)胞來源。內(nèi)毒素刺激腸黏膜肥大細(xì)胞釋放大量的TNF-α，進(jìn)而可以激活補(bǔ)體及巨噬細(xì)胞，釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如IL-6及IL-8等，啟動(dòng)免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)所構(gòu)成的炎性反應(yīng)系統(tǒng)和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)綜合癥MODS的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示，MLDL組肺泡灌洗液中的TNF-α及IL-6水平均明顯低于CLP組，其原因，一方面可能是MLDL可以“直接”阻斷并減少了膿毒癥時(shí)炎癥因子從淋巴途徑向肺臟的擴(kuò)散；另一方面，也可能是對(duì)“因腸道向肺臟擴(kuò)散的細(xì)菌及毒素引起的肺損傷”所致的繼發(fā)炎癥反應(yīng)的抑制作用。由于微淋巴管具有主動(dòng)吸收大分子物質(zhì)的功能，結(jié)扎腸系膜淋巴管可能阻斷了TNF-α等細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)自腹腔及腸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。通過對(duì)肺臟組織的通透性檢測(cè)，MLDL也可以減輕肺部損傷時(shí)的通透性，綜合考慮，這種“減輕通透性的作用”可能是繼發(fā)于減少了膿毒癥時(shí)肺部的細(xì)菌感染時(shí)造成的損傷，為一個(gè)“繼發(fā)性”保護(hù)作用?？偟膩碚f，MLD對(duì)于肺臟的保護(hù)作用，其“直接”機(jī)制為減少了膿毒癥時(shí)腹部細(xì)菌往肺部的擴(kuò)散，“間接”機(jī)制為減輕了肺部的炎癥及肺泡通透性。

然而，通過對(duì)腸道的病理學(xué)以及屏障功能相關(guān)的指標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MLDL對(duì)其無保護(hù)作用，這一點(diǎn)與之前研究結(jié)果不同。我們又檢測(cè)了血液、肺臟及腸道組織內(nèi)的細(xì)菌水平，發(fā)現(xiàn)MLDL可以減少血液及肺臟等“遠(yuǎn)隔臟器”的細(xì)菌含量，但是腸道內(nèi)的細(xì)菌水平無明顯變化，甚至有增加的趨勢(shì)，我們考慮結(jié)扎MLD可以阻斷來自腸道及腹膜的淋巴流，使得膿毒癥產(chǎn)生的有害物質(zhì)及細(xì)菌，難以輕易地經(jīng)MLD播散全身，但是這些被阻斷的有害物質(zhì)可能會(huì)在腸道及腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)積聚，進(jìn)而引起甚至加重腸道損傷。

淋巴學(xué)研究雖然在組織液回流、維持體液穩(wěn)態(tài)、機(jī)體免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移及淋巴水腫等方面有了很大進(jìn)展，但和血液學(xué)相比，淋巴學(xué)的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用研究長(zhǎng)期以來發(fā)展甚為緩慢[19-20]。本研究結(jié)果表明，淋巴微循環(huán)在膿毒癥的發(fā)病過程中有重要作用，MLDL可阻斷細(xì)菌經(jīng)腸系膜淋巴液運(yùn)輸，有效地降低炎癥因子及細(xì)菌往肺部的釋放，對(duì)膿毒癥大鼠的肺損傷有顯著的保護(hù)作用，減輕肺臟的功能障礙和形態(tài)損傷。但是其對(duì)于腸道損傷的作用則可能需要進(jìn)一步的研究，因?yàn)槟壳暗难芯拷Y(jié)果表明這種操作甚至可能會(huì)加重腸道的損傷，加重細(xì)菌在腸道組織內(nèi)的積聚。因此，需要綜合考慮此種手術(shù)操作的利弊，如何能規(guī)避腸道損傷是下一步研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

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