倪 雯 劉 佳 張弘雎

1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院原北陸參謀部門診部(250002)；2.山東省淄博市婦幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)是臨床產科較為常見的一種妊娠并發(fā)癥，增加不良妊娠結局的發(fā)生風險，嚴重危害母嬰健康[1]。發(fā)病機制尚未完全明確，臨床診斷需在孕中期檢測血糖予以判定，若能在早孕期利用相關生物學標志物預測或診斷GDM，將為GDM治療與改善新生兒預后帶來裨益。微小RNA(miR)是一類小的非編碼RNA，主要參與mRNA轉錄后調控，其在胎盤發(fā)育、細胞分化、細胞黏附、細胞轉移、細胞凋亡、血管生成等方面發(fā)揮著至關重要的作用[2]。近年來，妊娠相關疾病與外周血中miR表達失調的相關性研究已成為臨床熱點。近期有研究提出[3]，miR-200a可經Trp53/Bax信號通路促進胰島β細胞凋亡，進而引起2型糖尿病，miR-29在血糖誘導的胰島素分泌與胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用，但miR-200a、miR-29與GDM的關系尚不清楚。為明確miR-29、miR-200a在GDM患者外周血中的表達特征及臨床意義，本文進行對照研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院產科在2016年5月—2018年5月接診的GDM患者作為觀察組。另選取本院產科同期接診的糖耐量正常孕婦作為對照組。診斷依據(jù)國際妊娠與糖尿病研究組織制定的2015妊娠期糖尿病篩查指南[4]：①孕前體質指數(shù)(BMI)>24kg/m2；②既往有糖耐量異常史或糖尿病家族史；③既往存在流產、子癇前期、羊水過多、胎兒畸形、難產、死胎、死產史；④妊娠期間有胎兒過大、羊水過多等表現(xiàn)；⑤伴有反復假絲酵母菌感染；⑥受孕早期有尿糖表現(xiàn)。上述高危孕婦均在早孕期進行糖耐量試驗，低危孕婦則在孕24～28周進行糖耐量試驗，并結合空腹血糖、餐后2h血糖指標予以判定。2次測得的空腹血糖均≥7.0mmol/L，或隨機血糖≥11.1mmol/L，或75g OGTT試驗顯示空腹及服糖后1h、2h、3h血糖葡萄糖值中至少有兩項達到5.3mmol/L、10.0mmol/L、8.6mmol/L、7.8mmol/L即可診斷為妊娠期糖尿病。觀察組患者符合GDM診斷標準，對照組經OGTT篩查顯示糖耐量正常。同時排除年齡<18歲；合并妊娠期高血壓疾??；合并其他內科疾病；孕期接觸過有害物質；臍帶或胎盤異常；母嬰血型不合；多胎妊娠。所有入組對象均在本院產科住院分娩。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑電化學發(fā)光法胰島素檢測儀、全自動生化分析儀(美國Beckman公司生產)；PCR擴增儀(美國PE公司生產)；AM1560 RNA抽提試劑盒(美國Ambion公司生產)；TaqMan反轉錄試劑盒(美國APPS公司)。

1.2.2標本采集與檢測兩組研究對象均采集空腹靜脈血8ml，分裝于兩支試管中。一支試管使用EDTA抗凝保存，用于提取血清RNA；另一支試管用于檢測空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)水平。采血后口服葡萄糖液，服糖2h后再次采集靜脈血，用以檢測2hPG水平。①miR-29、miR-375、miR-200a檢測：按照試劑盒說明書抽提血清RNA并放置于-80℃冰箱保存。在16℃、42℃、85℃、4℃環(huán)境下各逆轉錄反應30min、30min、5min、5min，在95℃環(huán)境下行RT-PCR反應10min，45個循環(huán)的95℃反應15s，60℃反應60s。以U6 SnRNA為內參照，使用SDS1.4軟件計算Ct值，相對于U6 SnRNA的2-ΔΔCt為目的miRNAs的相對表達量。②FINS、FPG檢測：使用電化學發(fā)光法胰島素檢測儀測定FINS、FPG、2hPG、HbAlc值。

1.3 觀察指標

①比較兩組FINS、FPG、2hPG、HbAlc檢測值；②對比兩組的miR-29、miR-375、miR-200a表達量；③分析外周血miR-29、miR-375、miR-200a表達與FPG、2hPG、HbAlc、FINS的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 研究對象一般資料

觀察組80例，年齡(28.5±4.4)歲(20～39歲)，分娩孕周(39.3±0.7)周(38～41周)，BMI(23.5±2.4)kg/m2(20～26kg/m2)；對照組80例，年齡(27.8±3.6)歲(19～40歲)，分娩孕周(39.5±0.2)周(39～42周)，BMI(24.61±3.04)kg/m2(22～27kg/m2)。兩組資料比較無差異(P>0.05)。

2.2 兩組對象血糖檢測比較

觀察組FINS水平低于對照組，F(xiàn)PG、2hPG、HbAlc水平高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.3 兩組對象外周血基因表達量比較

觀察組外周血miR-29表達量低于對照組， miR-375、miR-200a表達量均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表1 兩組血糖檢測結果比較

表2 兩組外周血基因表達量比較

2.4 外周血基因表達與血糖指標相關性分析

相關性分析顯示，miR-29表達的ΔCt值與FPG、2hPG、HbAlc均呈正相關，與FINS呈負相關(P<0.05)；miR-375、miR-200a表達的ΔCt值均與FPG、2hPG、HbAlc呈負相關，與FINS呈正相關(P<0.05)。見表3。

表3 外周血miR-29、miR-375、miR-200a表達與血糖指標的相關性

3 討論

目前，臨床已有多種GDM預防手段，但總體效果并不滿意，多數(shù)GDM患者都是在孕中期才被發(fā)現(xiàn)，少數(shù)患者確診時甚至已處于孕晚期。GDM發(fā)現(xiàn)得越晚，對孕產婦及圍生兒的危害越大，而早期診斷GDM能夠盡早采取干預措施，穩(wěn)定地控制血糖，對于改善母嬰預后具有重要作用。

目前已有研究證實在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均有miRNA的參與，如自身免疫疾病、神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病、2型糖尿病、腫瘤等，故臨床可將外周血中的miRNA作為預測相關疾病的生物學標志物[5]。近期有文獻報道[6]，在GDM的發(fā)生、發(fā)展過程中均有miRNA的參與。miRNA在人體細胞、組織的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著至關重要的作用，高糖、高脂環(huán)境會對miRNA表達產生影響，所以miRNA表達異?？稍谝欢ǔ潭壬戏从硻C體的高糖、高脂狀態(tài)。人類血清中的miRNA種類繁多，不同的miRNA都具有較高的疾病特異性與穩(wěn)定性，將其作為預測各種疾病預后的標志物有較高的可靠性。

近期有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與胰島素的生成、分泌、作用以及胰島發(fā)育均有著密切聯(lián)系。miRNA在人體血液、血清中有高度的穩(wěn)定性， miRNA檢測具有準確、微創(chuàng)等優(yōu)點，所以越來越多的學者認為可將其作為糖尿病發(fā)病機制的靶點與診斷標志。miR-375主要由胰島β細胞表達，其能通過控制肌營養(yǎng)素水平來調節(jié)胰島素分泌。miR-29在血糖刺激的胰島素分泌與胰島素抵抗中發(fā)揮著關鍵性作用。動物實驗模型[7]顯示自發(fā)性糖尿病大鼠的miR-29表達水平顯著高于正常大鼠，而在自發(fā)性糖尿病大鼠的脂肪組織3T3-L1細胞系中檢測到了過表達的miR-29。miR-29的過表達會抑制胰島素激發(fā)的葡萄糖攝取能力，降低細胞對胰島素的敏感性，其與高胰島素、高血糖引起的胰島素失敏原理基本相同。據(jù)一項文獻報道顯示[8]，16～19孕周的GDM患者外周血miR-132、miR-222、miR-29a表達均顯著低于正常孕婦，提示miRNA可作為評估GDM的無創(chuàng)血清學標記物。

本次研究結果顯示，觀察組的FINS水平顯著低于對照組，F(xiàn)PG、2hPG、HbAlc水平顯著高于對照組，說明GDM的發(fā)生與β細胞功能下降導致的胰島素分泌減少有關。觀察組外周血miR-29表達量顯著低于對照組， miR-375表達量顯著高于對照組。這一結果與前述兩篇動物實驗研究結論相符，說明miR-375可調低PDK1表達，影響葡萄糖對胰島素基因表達的刺激能力，影響DNA合成，進而引發(fā)嚴重糖尿病。miR-375的高表達可促使胰島β細胞凋亡，miR-29的低表達則能通過抑制胰島β細胞分化、成熟來破壞胰島素分泌功能。在miR-29與miR-375表達異常的共同作用下，使胰島β細胞數(shù)量明顯減少，削弱胰島β細胞功能，進而引發(fā)GDM。miR-200是miRNA家族的重要成員，miR-200a是miR-200家族的成員之一，近年來關于miR-200a表達與糖尿病相關性的研究越來越多。國內有研究顯示，與正常孕婦相比，GDM患者胎盤及外周血中的miR-200a表達均明顯增加，且胎盤與外周血中的miR-200a表達水平接近。但也有研究顯示，16例孕16～19周GDM患者外周血中的miR-200a表達與正常孕婦接近。本次研究結果顯示，觀察組外周血中的miR-200a表達量顯著高于對照組，與前述研究結論不符，可能是因為前述研究選取的GDM樣本含量較小和檢測時間較早，而本次檢測時間多為孕晚期，提示miR-200a表達的升高在孕晚期表現(xiàn)更為明顯。本文相關性分析顯示，miR-29、miR-375、miR-200a表達的ΔCt值與FPG、2hPG、HbAlc、FINS均顯著相關，說明miR-29、miR-375、miR-200a異常表達均與GDM易感性密切相關。

綜上所述，外周血中miR-29、miR-200a、miR-375表達均血糖相關指標密切相關，miR-29、miR-200a、miR-375表達異常預示著GDM易感性。臨床可通過測定孕婦外周血miR-29、miR-375表達為臨床早期診斷GDM提供一定的參考依據(jù)，而miR-200a可能在孕晚期增加明顯，其對早期GDM的預測價值還有待進一步考證。